新近流行病学研究显示,中国糖尿病患者超过9240万,已成为世界糖尿病第一大国,其发病率呈不断上升趋势。其中,心血管疾病是糖尿病患者的主要致死原因。临床研究显示,糖尿病患者比正常人群心肌梗死患病率和死亡率高2-5倍。我们课题组前期研究发现,细胞凋亡在糖尿病心肌损伤中发挥重要作用,是缺血性心肌损伤的重要表现之一。激活PI3K-Akt-eNOS-NO为主的“生存信号”通路可减少心肌细胞凋亡,改善心功能,最终保护缺血/再灌注心脏。　　传统中药治疗糖尿病和心血管疾病有悠久历史和较好疗效。治疗糖尿病的中药复方以清热类和补气类药物为主,其中清热类药物—黄连的使用频率极高。但黄连治疗糖尿病及其心血管并发症的分子机制仍然不清。小檗碱(Berberine,BBR)为异喹啉类生物碱,是中药黄连的主要有效成分之一,被广泛应用于细菌性痢疾等胃肠道疾病的治疗。近年研究发现,BBR具有降低血糖,调节血脂代谢的作用。但与胰岛素降血糖作用机制不同,BBR降低血糖、调节血脂代谢的机制主要与激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)有关。此外,有报道显示BBR对充血性心衰患者有心脏保护作用,但具体机制尚不清楚。BBR能否减轻糖尿病条件下心肌缺血/再灌注损伤?其主要作用机制为何?阐明BBR对糖尿病心肌缺血/再灌注损伤的作用及机制,可望为揭示中药—黄连治疗糖尿病及其心血管并发症提供实验证据,并为开发相关植物药治疗糖尿病性心脏病提供新资料。　　研究目的:　　1.明确BBR对糖尿病大鼠缺血/再灌注心肌是否具有保护作用。　　2.探讨BBR发挥保护糖尿病大鼠缺血/再灌注心肌的作用机制,特别是BBR是否具有抗心肌细胞凋亡作用及其主要信号转导机制。　　研究方法:　　1.正常3周龄雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠给予小剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)联合高糖高脂饲料饮食喂养8 wks,制备2型糖尿病大鼠模型。将糖尿病大鼠随机分为4组进行灌胃:　　(1)糖尿病组(DM组),生理盐水,2 mL/kg/d,i.g.;　　(2)低剂量BBR组(DM+BBR100 mg/kg/d),BBR100 mg/kg/d,i.g.;　　(3)中剂量BBR组(DM+BBR200 mg/kg/d),BBR200 mg/kg/d,i.g.;　　(4)高剂量BBR组(DM+BBR400 mg/kg/d),BBR400 mg/kg/d,i.g.。　　每组10-20只,灌胃4 wks。　　2.BBR或生理盐水灌胃4 wks后,大鼠禁食8 h进行糖耐量试验(OGTT)。给予大鼠葡萄糖(5 g/kg BW)灌胃后在0、30、60、120、180 min时分别采尾静脉血,测定血糖水平。　　3.BBR或生理盐水灌胃4 wks后,结扎冠状动脉左前降支构建心脏缺血/再灌注模型(缺血30 min/再灌注3 h),并持续监测大鼠血流动力学各指标。再灌注结束后,制备心肌组织切片,采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位平端标记法(TUNEL)原位定量检测细胞凋亡。大鼠心肌缺血/再灌注实验分为5组,分别是:　　(1)糖尿病+假手术组(DM+Sham);　　(2)糖尿病+缺血/再灌注组(DM+I/R);　　(3)糖尿病+缺血/再灌注+低剂量BBR组(BBR100 mg/kg/d);　　(4)糖尿病+缺血/再灌注+中剂量BBR组(BBR200 mg/kg/d);　　(5)糖尿病+缺血/再灌注+高剂量BBR组(BBR400 mg/kg/d)。　　4.采用酶消化法分离、培养原代乳鼠心肌细胞。建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。原代乳鼠心肌细胞无糖无血清DMEM培养后置于1％O2,5%CO2,94%N2细胞培养箱中缺氧2 h,复氧即刻给予含不同浓度BBR的高糖培养液(含25 mmol/L葡萄糖)。复氧条件为常规培养箱(95%O2,5%CO2)培养2 h。将细胞随机分为:　　(1)高糖组(25 mmol/L葡萄糖,HG);　　(2)高糖+缺氧/复氧组(HG+H/R);　　(3)高糖+缺氧/复氧+低剂量BBR组(BBR0.5μmol/L);　　(4)高糖+缺氧/复氧+中剂量BBR组(BBR5μmol/L);　　(5)高糖+缺氧/复氧+高剂量BBR组(BBR50μmol/L)。　　5.分别采用MTT法检测心肌细胞生存率;采用Hoechst33342染色、TUNEL染色和流式细胞术检测心肌细胞凋亡率;收集细胞培养上清,用NO检测试剂盒测定NOx含量。　　6.Western Blot检测心肌细胞AMPK、Akt、eNOS表达和活性,测定PI3K、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达变化。　　研究结果:　　1.灌胃4 wks后,BBR可以降低糖尿病大鼠血糖水平。OGTT实验结果表明,与DM组相比,BBR200 mg/kg/d灌胃组和BBR400 mg/kg/d灌胃组不仅显著降低糖尿病大鼠空腹血糖水平(均为4.0±0.2 mmol/L,与DM组相比,P<0.01,n=6-15),而且显著改善糖尿病大鼠口服葡萄糖后30、60、120和180 min时血糖水平(P<0.01)。同时,BBR中剂量组显著升高糖尿病大鼠MI/R后再灌注末期心脏± LV dP/dtmax(与DM+ I/R组相比,P<0.01,n=6-15)。该结果说明,BBR可改善糖尿病大鼠缺血/再灌注后心脏收缩和舒张功能,促进其心脏功能恢复。此外,糖尿病大鼠缺血/再灌注后心肌细胞凋亡明显。BBR中剂量组可以抑制糖尿病大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡(P<0.05)。　　2.为了排除血糖降低对心脏的影响,进一步明确BBR对糖尿病大鼠缺血/再灌注心肌是否具有直接保护作用及其具体机制,我们采用乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型,发现,与单纯高糖组相比,HG+H/R显著降低心肌细胞存活率(P<0.01,n=6),复氧时分别给予不同浓度的BBR(0.5μmol/L,5μmol/L和50μmol/L)可浓度依赖性提高乳鼠心肌细胞存活率。其中BBR(50μmol/L)使HG培养的心肌细胞H/R后存活率提高至89.3±3.5%(与HG+H/R组相比,P<0.01,n=6)。同时,TUNEL染色法、Hoechst33342染色法和流式细胞术结果均表明,HG+H/R导致心肌细胞凋亡显著增加,而BBR(50μmol/L)处理可显著减少乳鼠心肌细胞凋亡,促进细胞存活(P<0.01,n=6)。　　3.为明确 BBR对糖尿病大鼠缺血/再灌注心肌发挥保护作用的机制,我们检测了BBR对HG+H/R时乳鼠心肌细胞NO生成的作用。结果显示,BBR(50μmol/L)可增加HG+H/R乳鼠心肌细胞NO的产生(P<0.05,n=6),增加心肌细胞PI3K的表达(1.6倍,与HG+H/R组相比,P<0.01),并提高Akt和eNOS的磷酸化水平(分别是2.6倍和1.7倍,与HG+H/R组相比,P<0.01)。且PI3K特异性抑制剂wortmannin可显著抑制BBR引起的PI3K的表达增加及Akt的磷酸化水平(P<0.01,n=6)。此外,BBR(50μmol/L)还可显著激活HG+H/R乳鼠心肌细胞AMPK,而给予AMPK的特异性阻断剂Compound C(1μmol/L)降低了BBR介导的AMPK磷酸化(P<0.01,n=6)。更重要的是,Compound C和wortmannin均可抑制 BBR介导的eNOS的磷酸化(P<0.05),并抑制心肌细胞NO生成(P<0.05,n=6)。上述结果表明BBR可分别激活PI3K/Akt和AMPK,促进eNOS活化,增加NO生成。　　4.Bcl-2、Bax和Caspase-3是细胞凋亡发生、发展中的重要信号分子。与单纯HG组相比,HG+H/R组乳鼠心肌细胞 Bcl-2/Bax的比值降低,而Caspase-3的活性升高(P<0.05,n=6)。BBR(50μmol/L)能显著增加Bcl-2/Bax的比值(P<0.01),降低Caspase-3激活水平(P<0.05)。Compound C或wortmannin均可抑制BBR对HG+H/R乳鼠心肌细胞的抗凋亡作用,使Bcl-2/Bax的比值降低(P<0.05)及Caspase-3激活水平增加(P<0.05),提示BBR的抗凋亡作用与激活 AMPK和PI3K/Akt有关。　　结论:　　1.BBR可降低2型糖尿病大鼠血糖水平,增加凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值,降低Caspase-3激活,减少缺血/再灌注心肌细胞凋亡,改善缺血/再灌注心脏收缩/舒张功能。　　2.BBR上述心脏保护作用与其激活AMPK和PI3K/Akt促进心肌细胞eNOS的磷酸化、增加NO生成有关。该结果也提示AMPK、Akt及eNOS可作为糖尿病心脏保护的潜在靶点。