肝癌是世界上发病率最高的癌症之一,临床一般采用手术切除、放疗、化疗等治疗方法,但由于其恶性程度高,转移性强,容易产生耐药等特点,对于治疗肝癌的新药研发迫在眉睫。本课题的研究对象依瓦菊内酯(Ivalin)来源于菊科植物天名精属大叶金挖耳,是由山东大学谢卫东课题组提取分离鉴定获得的一种天然桉烷内酯类化合物。大叶金挖耳分布于四川、贵州、湖南、福建以及东北等地,民间用来清热解毒,治疗感冒、头痛以及赤眼等疾病。在我们课题组前期的研究工作中,我们发现lvalin能够抑制人乳腺癌细胞的侵袭转移。在本课题中,我们发现其能够诱导肝癌细胞凋亡的作用,我们采用作用效果最强的SMMC-7721细胞作为研究对象,对其作用机制展开了探讨工作。通过MTT法我们检测了 Ivalin对系列肝细胞系的细胞毒性,我们发现其对人正常肝细胞HL7702的细胞毒性较低(25.86±0.87mol/L),对人肝癌细胞的细胞毒性较强,其中对肝癌细胞SMMC-7721细胞的毒性最强(4.34±0.10μmol/L)。首先,我们发现lvalin可以促进细胞微管的解聚、引起细胞G2/M期阻滞,从而导致细胞凋亡。通过免疫荧光技术和Western blot技术,我们发现Ivalin可以发挥类似于长春新碱促进肿瘤细胞微管解聚的作用。微管在细胞中发挥着细胞骨架支撑、细胞内物质运输等作用,同时参与细胞的有丝分裂过程。因此我们检测了 Ivalin作用后SMMC-7721细胞的细胞周期分布情况,结果显示Ivalin处理后导致SMMC-7721细胞产生G2/M期阻滞。通过Western blot技术进一步检测周期相关蛋白的表达情况,我们发现Ivalin作用后周期相关蛋白Cdc25A和Cyclin B1的表达上调。此外我们观察到Ivalin诱导的细胞G2/M期阻滞在0-24 h呈累积增加的趋势,24 h后周期阻滞情况不增反降,我们推断可能部分细胞死亡,随后的Annexin和PI双染结果也证实Ivalin诱导了细胞凋亡。此外,我们发现Ivalin还可以通过线粒体途径诱导肝癌细胞SMMC-7721细胞凋亡。通过流式细胞技术我们发现Ivalin可以引起肿瘤细胞活性氧的累积。通过RT-PCR和Western blot技术我们发现Ivalin可以调节NF-κB、p53和Bax的转录并影响相关蛋白的表达,因此Ivalin诱导的凋亡与NF-κB和p53的激活有关。通过JC-1染色我们发现Ivalin可以降低线粒体膜电势,引起细胞线粒体膜通透性增加,从而导致细胞色素C释放到胞质中,引起Caspase3的激活,进而引起细胞线粒体途径凋亡的发生。综上所述,我们推测Ivalin可能是一种多靶点诱导肝癌细胞凋亡的活性化合物。一方面Ivalin可以通过促进肝癌细胞的微管发生解聚,引起细胞G2/M期阻滞,并进一步诱导细胞凋亡;另一方面Ivalin还可以通过细胞内活性氧的累积激活NF-κB、p53的表达,从而引起细胞线粒体途径凋亡的发生。作为抗肿瘤天然化合产物,Ivalin具有极大的开发潜能,我们的研究也为其进一步活性评价、化合物结构优化奠定了坚实的基础。