椎间盘退变是引起成人腰腿痛、颈肩痛的主要原因。随着人均寿命的延长和社会工作压力增大,椎间盘退变性疾病的发病率明显升高,而目前的保守治疗和外科手术治疗均不能从根本上,解决患者的病情。通过动物实验及临床初步应用证明,椎间盘移植后可以异体存活,并能完全缓解患者的临床症状,就其生物力学方面亦可满足生理活动需要,但植入的异体椎间盘在生化代谢及组织学上有明显的退行性改变,这将导致临床症状的再次出现,并可能出现椎间盘活动度消失等并发症。最近的研究结果显示椎间盘内细胞活性的提高能延缓甚至阻止椎间盘退变性改变。因此本实验拟通过以异体椎间盘为支架材料,以表达外源性人BMP7的髓核细胞为种子细胞,体外构建组织工程椎间盘,并观察组织工程椎间盘的生物活性及功能情况。1.深低温储存温度及时间对异体椎间盘生物活性的影响目的:探讨不同的深低温储存温度及储存时间对异体椎间盘生物活性影响,获得最适合临床应用的保存条件。方法:取犬椎间盘52只,分为对照组、液氮保存组和-80℃保存组。在冷冻保存液中分别储存于液氮及-80℃低温冰箱中,在储存的2w、1m、2m、4m、6m及12m时,通过EB/FAD法检测椎间盘组织中不同部位的细胞存活率,以DMMB法检测髓核组织蛋白多糖(PG)含量,以羟脯氨酸法检测髓核组织中的总胶原含量。结果:各检测时间点两组间外层纤维环细胞活性明显高于内层纤维环及髓核组织(p<0.05),内层纤维环及髓核组织间细胞活性未见明显不同;在内层纤维环及髓核组织中,细胞存活率在储存2w时,可见液氮组明显高于-80℃组(p<0.05),自储存1月起至12个月,两组间均无明显差别(p>0.05)。在储存期间两储存组蛋白多糖含量均逐渐降低,在1m至12m储存期间,液氮保存组蛋白多糖含量均高于-80℃保存组。而两组间总胶原蛋白含量在储存期间随时间逐渐降低,但两组间未见明显差异。结论:利用液氮保存椎间盘组织,无论在细胞总的存活率及PG含量上均优于-80℃,1年的液氮保存期间,细胞存活率及功能蛋白PG含量均在一个恒定的水平,能满足异体椎间盘移植的基本要求,可作为组织工程椎间盘的支架材料。2.重组腺相关病毒人BMP7(rAAV2-hBMP7)病毒载体的构建及鉴定目的:探讨能否利用pSNAV2.0质粒构建系统构建pSNAV2.0-hBMP7穿梭质粒,并包装纯化成可供实验用rAAV-hBMP7病毒载体。方法:利用AgeI和NheI酶切pDC316-hBMP7-IRES-EGFP质粒,回收纯化hBMP7基因片段,以AgeI和NheI酶切载体质粒pSNAV2.0-LacZa,回收纯化pSNAV2.0载体质粒片段,利用T4 DNA连接酶将纯化回收的hBMP7基因与pSNAV2.0载体质粒片段连接构建,并转化入感受态大肠杆菌DH-5α进行扩增纯化,测序鉴定;用Lipofectamine 2000将序列正确的pSNAV2.0- hBMP7质粒转染至BHK-21细胞,G418选择培养,并大量扩增至所需并用HSV1-rc/ΔUL2辅助病毒感染,以PEG8000/NaCl沉淀,以氯仿纯化浓缩、检测滴度及纯度。结果:成功构建了pSNAV2.0- hBMP7质粒,经PCR、酶切和测序鉴定构建正确。利用Lipofectamine 2000将序列正确的pSNAV2.0- hBMP7质粒转染至BHK-21细胞,并通过含有G418的培养基,选择性扩增,并浓缩纯化出了滴度达5.1×1011 v.g、纯度>97%的rAAV-hBMP7病毒载体。结论:利用pSNAV2.0质粒包转系统能成功将外源性基因hBMP7包装成滴度及纯度满足实验要求的rAAV-hBMP7病毒载体。3.介导人骨形成蛋白-7的2型腺相关病毒转染髓核细胞及其对髓核细胞表型的影响目的:以介导外源性人骨形成蛋白-7(hBMP7)基因的2型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus type-2,rAAV2)载体转染犬髓核细胞(canine nucleus pulposus cell, cNP cell),观察转染后髓核细胞hBMP7蛋白表达,并分析髓核细胞生物功能变化。方法:实验组以最佳感染复数(MOI)1×105 vg/cell转染犬髓核细胞,对照组以相同MOI的不含hBMP7基因的rAAV2-EGFP病毒感染。在转染后4d、7d和14d分别以RT-PCR、Wenstenbloting方法分别对两组髓核细胞中hBMP7的mRNA转录及蛋白表达进行检测。在转染后的第7天,检测两组细胞增殖能力。在转染后的4、7和14d,利用real-time PCR、DMMB及Elisa法分别检测蛋白多糖、Ⅰ和Ⅱ胶原的mRNA含量、蛋白多糖含量及Ⅰ和Ⅱ型胶原蛋白含量。结果:在以1×105 vg/cell转染犬髓核细胞后,在4d、7d和14d时均可检测到实验组髓核细胞中高表达hBMP7 mRNA,而对照组,无论在何时间点均不能检测到hBMP7 mRNA的转录,半定量分析显示,7d时mRNA含量较高。Westenbloting蛋白检测结果显示:7d、14d时,实验组均可检测到分子量为55kd特异性hBMP7蛋白的表达,而对照组均未观察到阳性蛋白条带。半定量分析显示:转染后7d时hBMP7蛋白含量相对较高。在转染7天后,转染组与未转染组细胞增殖能力未见明显区别。对实验组髓核细胞的Real-time PCR定量分析发现:蛋白多糖、Ⅱ型胶原mRNA在转染后第4天无明显增加,但在第7天和14天均明显增高。而Ⅰ型胶原mRNA在4、7和14天均未见明显变化。实验组蛋白多糖含量第4天未见明显变化,而第7、14天较对照组分别增高42%及77%。而Ⅰ胶原含量两组间未见明显增加,实验组Ⅱ型胶原含量在第4天未见明显增加,而第7、14天分别较对照组增高63%及94%。结论: rAAV2-hBMP7病毒载体能有效地转染犬髓核细胞并长期稳定表达人骨形成蛋白-7,并能提高犬髓核细胞蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量,这将能为组织工程椎间盘提供可选择的基因修饰的种子细胞。4.组织工程椎间盘的体外构建目的:探讨利用液氮储存异体椎间盘及表达外源性人BMP7的髓核细胞体外构建组织工程椎间盘的方法方法:取储存于液氮中2个月的犬椎间盘24只,分为EGFP对照组、1×104、1×105和1×106四组,每组6只。对照组用16G注射器自椎间盘后正中注入1×105的表达EGFP的髓核细胞20ul, 1×104组注入PKH-26标记的表达hBMP7的髓核细胞20ul,其总细胞数为1×104,1×105组为总细胞数1×105的PKH-26标记的表达hBMP7的髓核细胞20ul,1×106组为细胞总数1×106的PKH-26标记的表达hBMP7的髓核细胞20ul。注射后立即置入50ml离心管中,加入30ml完全培养基,分别于培养4、7、14天,从椎间盘形态、细胞存活、及髓核细胞荧光强度、蛋白多糖及胶原含量等方面进行评价。结果:在储存的第4天及7天,椎间盘外形基本未见明显改变,而在储存至14天时,可见椎间盘上下终板有钙质脱落。在各时间点均可见表达绿色荧光蛋白髓核细胞。对不同组、不同时间点的组织工程椎间盘中荧光强度定量后发现:培养第7和14天时,1×105组荧光强度明显高于1×106组和1×104组。而且1×105组培养第7和14天时蛋白多糖及总胶原含量均较另外三组明显增高。结论:利用液氮储存异体椎间盘同1×105转染髓核细胞复合,体外培养7天能构建出较理想的组织工程椎间盘。小结:1.利用液氮保存椎间盘组织,无论在细胞总的存活率及PG含量上均优于-80℃,1年的液氮保存期间,细胞存活率及功能蛋白PG含量均在一个恒定的水平,能满足异体椎间盘移植的基本要求,可作为组织工程椎间盘的支架材料。2.利用pSNAV2.0质粒包转系统能成功将外源性基因hBMP7包装成滴度及纯度满足实验要求的rAAV-hBMP7病毒载体。3. rAAV2-hBMP7病毒载体能有效地转染犬髓核细胞并长期稳定表达人骨形成蛋白-7,并能提高犬髓核细胞蛋白多糖及Ⅱ型胶原含量,这将能为组织工程椎间盘提供可选择的基因修饰的种子细胞。4.利用液氮储存异体椎间盘同1×105转染髓核细胞复合,体外培养7天能构建出生物活性较高组织工程椎间盘。这将能被用于进一步动物实验,以研究组织工程椎间盘的生物活性。