【摘 要】
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目的:了解结核分枝杆菌跨膜蛋白Rv3737对巨噬细胞极化的影响,探讨Rv3737是否通过调节巨噬细胞极化影响分枝杆菌在巨噬细胞内的存活及调控机制。方法:本实验组前期构建了过表达Rv3737的耻垢分枝杆菌（MS＿Rv3737）和敲除Rv3737的结核分枝杆菌（H37Rv△Rv3737）,对照组分别为含有空载的耻垢分枝杆菌（MS＿Vec）和结核分枝杆菌标准菌株（H37Rv-WT）,利用Western-
【基金项目】
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贵州省科学技术基金（基金课题编号:黔科合支撑[2019]2804号;黔科合基础-ZK[2021]一般348;黔科合支撑[2021]一般437）; 国家自然科学基金（基金课题编号:81960004）
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目的:了解结核分枝杆菌跨膜蛋白Rv3737对巨噬细胞极化的影响,探讨Rv3737是否通过调节巨噬细胞极化影响分枝杆菌在巨噬细胞内的存活及调控机制。方法:本实验组前期构建了过表达Rv3737的耻垢分枝杆菌（MS＿Rv3737）和敲除Rv3737的结核分枝杆菌（H37Rv△Rv3737）,对照组分别为含有空载的耻垢分枝杆菌（MS＿Vec）和结核分枝杆菌标准菌株（H37Rv-WT）,利用Western-blot和PCR方法对重组菌株进行验证,并培养于7H9液体培养基中进行生长曲线测定;利用MS＿Rv3737及MS＿Vec或H37Rv△Rv3737及H37Rv-WT菌株感染RAW264.7巨噬细胞,CFU计数法检测分枝杆菌在巨噬细胞内的存活情况,Real-time PCR检测M1型极化相关细胞因子i NOS、IL-6、TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-12b和M2型极化相关细胞因子Arg-1、TGF-β、IL-10的m RNA水平,ELISA检测细胞培养上清中i NOS、IL-6、TNF-α、Arg-1的蛋白质水平,流式细胞术检测巨噬细胞极化相关的表面标志物CD86和CD206的表达,Western-blot检测巨噬细胞极化的标志蛋白i NOS、Arg-1水平。Real-time PCR筛选极化相关信号通路中关键信号分子的表达以筛选出靶通路,通过Western-blot对靶通路NF-κB信号通路中P65、IκB和MAPK通路中P38、JNK、ERK的磷酸化水平进行检测。最后,加入NF-κB和MAPK信号通路抑制剂通过Real-time PCR和ELISA检测该通路对上述极化细胞因子的调控。用Graphpad prism 6.0软件进行数据整理和差异分析,了解结核分枝杆菌跨膜蛋白Rv3737是否通过影响巨噬细胞极化从而调节结核分枝杆菌在巨噬细胞内的存活。结果:过表达菌株MS＿Rv3737和空载菌株MS＿Vec经Western-blot和PCR验证构建成功,敲除菌株H37Rv△Rv3737经PCR验证敲除成功,过表达及敲除Rv3737均不影响结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的体外生长,但重组菌株感染巨噬细胞后,CFU计数结果提示过表达耻垢分枝杆菌的Rv3737促进耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活,而敲除结核分枝杆菌Rv3737后抑制了结核分枝杆菌在巨噬细胞内的存活;过表达Rv3737后明显促进了M2型极化相关细胞因子Arg-1、TGF-β、IL-10的m RNA水平升高及Arg-1的蛋白水平升高;相反,敲除结核分枝杆菌Rv3737后明显抑制了巨噬细胞M2型极化相关细胞因子的表达,而M1型极化细胞因子i NOS、IL-6、TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-12b的m RNA水平以及i NOS的蛋白质水平升高;同时,流式细胞术结果表明过表达Rv3737的耻垢分枝杆菌感染的巨噬细胞高表达CD206。通过Real-time PCR检测调控巨噬细胞极化相关分子的转录水平,结果显示Rv3737主要调控AP-1和NF-κB的转录水平。通过Western-blot检测过表达Rv3737后NF-κB信号通路中p65、IκB和MAPK信号通路中P38、JNK、ERK的磷酸化水平均降低,相反,敲除菌株感染巨噬细胞后相关分子的磷酸化水平升高。最后,通过抑制NF-κB及MAPK相关通路后,Real-time PCR和ELISA检测相关细胞因子的表达,结果显示抑制MAPK通路后,细胞因子改变不明显,表明Rv3737主要通过NF-κB通路调控巨噬细胞的极化。结论:耻垢分枝杆菌过表达Rv3737及结核分枝杆菌敲除Rv3737后不影响分枝杆菌的体外生长,但Rv3737明显促进结核分枝杆菌在巨噬细胞内的存活,且Rv3737促进巨噬细胞向M2型极化,抑制促炎细胞因子的产生,这种作用主要是通过调节NF-κB信号通路实现的。
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