中药是我国宝贵的文化遗产,具有防治疾病、康复保健等作用,市场应用广泛。近年来,中药中农药残留成为备受关注的焦点问题,残留农药是否对生物体产生毒性作用已经引起科学工作者的高度重视。所以中药中残留农药的毒性研究就变得尤为重要。鉴于以上背景,本课题组前期工作鉴定出关防风,五味子中残留的有β-BHC、p,p’-DDT、HCB三种有机氯农药。五味子中p,pDDT、β-BHC、HCB残留含量分别为:63.1ug/kg、31.2 ug/kg、33.2 ug/kg。关防风中 β-BHC、p,p’-DDT、HCB 残留含量分别为42.35 ug/kg、35.83ug/kg、21.67 ug/kg。以上三种农药的单一含量均符合国家药典2010版的残留标准,但由于残留的农药是含有三种物质的混合物,混合后是否产生毒性效应未见研究,其对生物体是否有毒性危害需要做更进一步的研究,故本实验就残留的农药提取物对卵巢颗粒细胞(GC)及睾丸支持细胞(SC)毒性做了研究,以小鼠的GC、SC为研究对象,建立体外培养体系,研究残留农药提取物对生殖毒性的影响。本实验对五味子中残留农药对卵巢颗粒细胞毒性影响进行了研究。通过胰酶混合消化提取卵巢颗粒细胞;用倒置显微镜和荧光显微镜观察活细胞形态及培养状态;HE染色法和FSHR免疫组化法对提取出的细胞进行纯化及鉴定;鉴定结果显示,提取分离出的颗粒细胞纯度高,可达80%以上,为后期实验提供了有效地支持。用MTT法检测农药提取物对卵巢颗粒细胞的毒性影响,结果显示,提取物对卵巢颗粒细胞作用24、48、72h均产生不同程度的增殖作用,与阴性对照组比较差异显著(P<0.05),并且作用48h细胞增殖效果最为显著(P<0.01)。采用Western Blot法比较农药提取物对颗粒细胞ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达水平的影响情况,结果发现:农药提取物能显著促进ERK1/2、p-ERK1/2蛋表达,上调ERK、p-ERK蛋白表达水平,与阴性对照相比差异极显著(P<0.01)。故得出结论,农药提取物可以促进卵巢颗粒细胞的增殖,并影响卵巢颗粒细胞内ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达水平,对细胞的ERK信号转导通路造成一定程度的影响,干扰了下游信号级联放大,破坏颗粒细胞的正常生理功能,损伤小鼠卵巢器官,引发雌性生殖毒性。实验针对关防风中残留农药对睾丸支持细胞毒性影响进行了研究,采用双酶消化法,提取出支持细胞,用波形蛋白免疫化学法、油红O染色法以及HE染色法进行鉴定。鉴定结果显示,提取分离出的支持细胞纯度高,可达80%以上,为后期的实验提供了有效地支持。MTT结果显示,残留农药提取物作用于支持细胞后,细胞均产生不同程度增殖作用(P<0.05),而在48h时细胞增殖率最大,与阴性对照组相比具有极显著差异(P<0.01)。Western Blot结果显示,支持细胞在体外培养条件下能良好地表达ERK1/2、p-ERK1/2蛋白,可见体外实验方法能用于ERK1/2、p-ERK1/2蛋白与睾丸支持细胞毒性作用的研究。故得出结论,农药提取物可以促进支持细胞的增殖,并影响支持细胞内ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的表达水平,对细胞的ERK信号转导通路构成一定程度的影响,破坏了支持细胞的正常生理功能,损伤小鼠睾丸器官,引发雄性生殖毒性。