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目的：肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration，ALR）是近年发现的参与肝脏修复与再生的调控因子。在多种组织中ALR均有表达，尤其在肿瘤组织中表达明显增强。细胞凋亡是肿瘤细胞丢失的一种方式，对细胞凋亡的躲避，则是癌症的基本特征之一，所以，诱导肿瘤细胞凋亡是癌症化疗的一个主要目标。已有研究发现，ALR有抗凋亡的作用，而在肝癌中表达明显的ALR是否也通过抗凋亡的作用来影响化疗的效率仍未知。本研究拟通过用顺铂诱导HepG2凋亡，外源性加入ALR以及抑制肝癌细胞HepG2中ALR的表达，探讨ALR在顺铂诱导HepG2凋亡中的研究。第一部分外源性ALR对顺铂诱导HepG2凋亡中的影响方法：以HepG2为实验细胞，主要分为2个组：对照组（DDP—,ALR＋），实验组（DDP+，ALR＋），DDP的作用浓度为10ug/ml，ALR的作用浓度分别为：0、5、10、20ug/ml，总作用时间均为24h。1.用MTS法检测ALR对HepG2细胞的增殖作用：细胞种板于96孔板中，贴壁后分别外源性加入不同浓度的ALR，作用24h时后检测OD490值；2.MTS法检测ALR对顺铂诱导的HepG2细胞增殖抑制的影响：HepG2细胞接种96孔板，加入顺铂（10ug/ml）的同时加入不同浓度的ALR，并以HepG2（DDP－，ALR－）细胞为空白对照，检测顺铂对HepG2细胞的抑制率；3.流式细胞仪检测凋亡率的变化：上述2组细胞中分别外源性加入不同浓度的ALR，作用24h后检测凋亡率；4.western blot检测凋亡相关蛋白的表达情况：实验组外源性加入不同浓度的ALR24h后，检测pro-PARP, cleaved-PARP，pro-caspase8,pro-caspase3，Bcl-2，Bax的蛋白表达情况。其中，以HepG2（DDP－，ALR－）细胞的相关凋亡蛋白为空白对照，β-actin为内参蛋白。结果：1.MTS结果显示：1）外源性加入ALR(0、5、10、20ug/ml)后，HepG2细胞增殖明显（p<0.05），且呈剂量依赖性增殖；2）DDP作用于HepG2时，细胞增殖受到明显抑制（p<0.05），但是加入ALR后，这种抑制作用被减弱（p<0.05）。2.流式细胞仪结果显示：仅外源性加入ALR(0、5、10、20ug/ml)，细胞凋亡率无明显变化，分别为（5.20±0.95）%、（5.03±0.37）%、（4.97±0.35）%、（4.85±0.23）%，其差异无统计学意义（p>0.05）；加入DDP的同时也加入不同浓度的ALR时，细胞凋亡率呈剂量依赖性降低，分别为：（60.97±6.56）%、（53.03±2.60）%、（40.63±2.02）%、（30.0±3.21）%，其差异具有统计学意义（p<0.05）。3.western blot结果显示：与HepG2（DDP－，ALR－）细胞相比，HepG2（DDP+，ALR－）细胞中的Pro-PARP、Pro-caspase8、Pro-caspase3和Bcl-2的表达下调，cleaved-PARP、Bax的表达上调。HepG2（DDP+，ALR＋）组内的细胞，Pro-PARP、Pro-caspase8、Pro-caspase3和Bcl-2的表达随着ALR变化呈剂量依赖性上调；cleaved-PARP、Bax则随ALR剂量依赖性下调。结论：1.外源性ALR对正常HepG2细胞的凋亡率无明显作用；2.顺铂可显著抑制HepG2的增殖，外源性的ALR可减少顺铂对HepG2的抑制作用；3.顺铂可诱导HepG2凋亡，外源性ALR可降低顺铂作用的HepG2细胞的凋亡率；4.外源性ALR降低顺铂诱导的HepG2凋亡，主要通过调节caspase8、caspase3、Bax/Bcl-2、PARP裂解度。第二部分抑制内源性ALR表达对顺铂作用HepG2凋亡的影响方法：以HepG2、HepG2-NC（慢病毒空载体）细胞、 HepG2-KD（干扰ALR表达的慢病毒载体）细胞为实验细胞。DDP的作用浓度为5ug/ml，ALR的作用浓度为20ug/ml，总作用时间均为24h。1.Western blot检测HepG2、HepG2-NC、HepG2-KD中ALR的表达；2.用MTS法检测细胞的增殖：取对数生长期的HepG2、HepG2-NC、HepG2-KD细胞接种于96孔板中，贴壁后每种分别做以下处理：（1）（DDP－，ALR－）；（2）（DDP+，ALR－）；（3）（DDP+，ALR＋）。作用24h后，检测不同处理方式后的OD490；3.流式细胞仪检测细胞的凋亡率：HepG2、HepG2-NC、HepG2-KD细胞经以下处理24h后，在FCM上检测细胞的凋亡率：（1）（DDP－，ALR－）；（2）（DDP+，ALR－）；（3）（DDP+，ALR＋）。4.Western blot检测凋亡相关蛋白的表达情况：把HepG2-NC、HepG2-KD细胞经（1）（DDP－，ALR－）；（2）（DDP+，ALR－）；（3）（DDP+，ALR＋）作用24h后，检测细胞中pro-PARP, cleaved-PARP，pro-caspase8, pro-caspase3，Bcl-2，Bax的蛋白表达情况。结果：1.HepG2-KD细胞中ALR的表达明显下调。2.MTS结果显示：HepG2、HepG2-NC、HepG2-KD的OD490分别为(0.81±0.02)、(0.71±0.01)、(0.6±0.07)；经（DDP+，ALR－）处理后，HepG2、HepG2-NC、HepG2-KD细胞的OD490分别为(0.41±0.04)、(0.41±0.03)、(0.14±0.00)；经（DDP+，ALR＋）处理后，细胞的OD490分别为(0.69±0.02)、(0.69±0.02)、(0.47±0.02)。其中，HepG2与HepG2-NC的各处理结果，均无统计学意义（p＞0.05）；HepG2-NC与HepG2-KD的各处理结果均有统计学意义（p＜0.05）；（DDP－，ALR－）与（DDP+，ALR－）相比，差异有统计学意义（p＜0.05），（DDP+，ALR－）与（DDP+，ALR＋）相比，差异有统计学意义（p＜0.05）。3.流式细胞仪结果显示HepG2、HepG2-NC、HepG2-KD的凋亡率分别为（0.97±0.21）%、（1.08±0.13）%、（5.37±0.7）%；经（DDP+，ALR－）处理后，HepG2、HepG2-NC、HepG2-KD细胞的凋亡率分别为（20.9±0.62）%、（23.07±2.21）%、（37.53±2.34）%；经（DDP+，ALR＋）处理后，细胞的凋亡率分别为（6.03±0.32）%、（6.57±0.85）%、（25.1±1.93）%；其统计学分析结果同上。4.Western blot结果显示：与HepG2-NC相比，HepG2-KD的凋亡蛋白Pro-PARP、Pro-caspase8、Pro-caspase3和Bcl-2的表达上调，Bax、cleaved-PARP的表达下调；经（DDP+，ALR－）处理后，HepG2-KD的凋亡蛋白Pro-PARP、Pro-caspase8、Pro-caspase3和Bcl-2较HepG2-NC表达下调，Bax、cleaved-PARP的表达上调；细胞经（DDP+，ALR＋）处理后，HepG2-KD的凋亡蛋白Pro-PARP、Pro-caspase8、Pro-caspase3和Bcl-2的表达较HepG2-NC上调，而Bax、cleaved-PARP的表达下调。结论:1.siRNA/ALR可有效阻断ALR的表达；2.ALR干扰后，细胞的增殖受到明显抑制，凋亡率明显增高；3.顺铂作用于ALR干扰后的细胞，其细胞增值率进一步下调，凋亡率进一步增加，从而增强HepG2对顺铂的敏感性；当再外源性加入ALR时，细胞的凋亡明显减少；4.ALR干扰后细胞的凋亡率增加与调节caspase8、caspase3、Bax/Bcl-2、PARP裂解度有关。