目的:随着人类科技和医疗水平的提高,许多旧时代的不治之症变得可以通过治疗痊愈。但是随着人类寿命的延长,癌症成为了人类生命之路上的最大阻碍,目前还未找到对其有效且副作用小的治疗方法。癌症是恶性肿瘤的一种,其病因比较复杂,分为内源性与外源性两种。但本质上是由于原癌基因、抑癌基因以及癌症相关的基因发生改变而引起,这是一个逐渐转变的过程。在这个过程不断的完成时,即人体内的肿瘤相关因子发生了量变到质变的转变,肿瘤随之发生。在这个过程之中,有一个必不可少的因素扮演了主要的角色,即肿瘤相关的信号通路。随着近些年的研究发现,人们对肿瘤细胞中信号转导的机制也逐渐明晰。因此,对某些激酶的信号通路进一步探索,将其中关键性的激酶作为靶点,以其作为抗癌药物的主要筛选要求,成为了目前主要的抗癌药物研发的道路之一。p21激活激酶(PAK)是丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,已被鉴定为Rho家族GTP酶的下游信号效应因子。目前的研究表明,可将哺乳动物PAK家族分为6个成员,根据它们的结构同源性和生物化学特征,又可将其分为两类:Ⅰ类有PAK1、PAK2、PAK3;Ⅱ类有PAK4、PAK5、PAK6。PAK通过在Ras-Rac/Cdc42-PAK通路中发挥着不可或缺的作用,在基础的细胞生理过程中起到不可替代的作用,包括细胞骨架重塑、细胞运动、细胞形态变化、周期演进等等。其中PAK4在许多肿瘤细胞中存在,并且目前研究表明,PAK4在其中存在着异常的改变,如过表达、扩增、突变等。在过去的研发中,人们已经开发出了一些PAK抑制剂,其在PAK家族不同类别中表现出不同的选择性。但针对PAK4的高选择性临床药物尚未出现。2,4-二胺基喹唑啉化合物LCH-7749944,作为中度PAK4抑制剂,其PAK4IC 50=15μM;PAK1 IC 50=50μM,值得注意的是,它对PAK4的抑制具有比PAK1更高的效力,具有一定的PAK4/1选择性,同时伴随PAK4/LIMK1/cofilin和PAK4/MEK-1/ERK1/2/MMP2通路的阻断。我们与沈阳药科大学合作,围绕2,4-二胺基喹唑啉类化合物进行了大量的结构衍生工作,得到了一类结构多样的化合物,并通过一系列改构优化合成,获得多个高活性PAK4抑制剂:CZh140、CZh196、CZh216、CZh225、CZh226。我们采用Z-Lyte~?激酶实验(Z-Lyte TM Kinase Assay)技术对其进行评价,其中PAK4选择性最明显的CZh226表现出了最佳的效力和选择性。验证了该化合物对PAK4激酶活性的抑制作用以及靶向选择作用。因此,我们进一步进行CZh226对肺腺癌细胞的生物学功能学实验,探究其对此类癌细胞的抑制效应。这将为以后的抗癌药物研发提供新的思路。研究方法:1.CZh226、CZh140、CZh196、CZh216、CZh225对肺癌细胞及HEK293细胞增殖的影响的研究:1)MTT比色法研究CZh226、Czh140、Czh196、Czh216、Czh225对肺腺癌A549细胞增殖的影响。2)MTT比色法研究CZh226对人大细胞肺癌H460细胞增殖的影响。3)MTT比色法研究CZh226对人胚肾细胞HEK293细胞增殖的影响。2.探究CZh226、CZh140、CZh196、CZh216、CZh225对肺癌细胞、HEK293细胞侵袭迁移能力的抑制作用:1)Transwell实验研究CZh226、CZh140、CZh196、CZh216、CZh225对肺腺癌A549细胞迁移及侵袭能力的抑制作用。2)Transwell实验研究CZh226对人大细胞肺癌H460细胞迁移及侵袭能力的抑制作用。3)Transwell实验研究CZh226对人胚肾细胞HEK293细胞迁移及侵袭能力的抑制作用。4)划痕实验研究CZh226对肺腺癌A549细胞迁移作用的影响。5)Confocal实验研究CZh226对肺腺癌A549细胞微丝的影响,进而对迁移的影响。3.Western Blot研究CZh226对GEF-H1、LIMK1、cofilin、MMP2等细胞侵袭转移相关蛋白表达的影响:使用A549细胞进行Western Blot实验。4.采用激酶选择性实验,检测CZh226对PAK家族六种成员的抑制活性。5.采用代谢稳定性评估实验:大鼠肝微粒体孵育实验及血浆稳定性实验检测CZh226的大鼠微粒体代谢稳定性和血浆稳定性。6.采用静脉注射和口服CZh226两种方式,检测CZh226在大鼠体内的药代动力学性质。结果:1.CZh226、CZh140、CZh196、CZh216、CZh225对肺癌细胞及HEK293细胞的增殖影响不明显:1)MTT比色法实验结果表明,CZh226、CZh140、CZh196、CZh216、CZh225对肺腺癌A549细胞的增殖抑制作用不明显。2)MTT比色法实验结果表明,CZh226对人大细胞肺癌H460细胞的增殖抑制作用不明显。3)MTT比色法实验结果表明,CZh226对人胚肾细胞HEK293的增殖有抑制作用不明显。2.CZh226、CZh140、CZh196、CZh216、CZh225抑制肺癌细胞及HEK293细胞的侵袭转移能力:1)CZh226、CZh140、CZh196、CZh216、CZh225对A549细胞的迁移能力有明显的抑制作用。2)CZh226对人大细胞肺癌H460细胞的迁移能力抑制作用不明显3)CZh226对人胚肾细胞HEK293细胞的迁移能力抑制作用不明显。4)划痕实验结果表明A549细胞划道愈合速度随着CZh226的浓度增加而减弱。5)Confocal实验结果表明A549细胞的微丝随着CZh226的浓度增加而减少。3.CZh226抑制肺腺癌A549细胞中PAK4激酶的活性及PAK4下游迁移侵袭相关蛋白LIMK1、cofilin、GEF-H1、MMP-2的活化和表达。4.在0.1μM的测试浓度下,CZh226在PAK六种亚家族成员中抑制活性PAK4>PAK5>PAK6>>PAK1-3。5.代谢稳定性实验结果表明CZh226具有良好的大鼠微粒体代谢稳定性和血浆稳定性6.对化合物CZh226的大鼠体内药代动力学性质评价发现,静脉给药具有较好的半衰期及药物暴露量,可满足进一步体内药效学研究。结论:1.CZh226、CZh140、CZh196、CZh216、CZh225是我们自己设计并合成的对PAK4激酶选择性高且抑制作用明显的PAK4小分子抑制剂;2.CZh226对肺腺癌A549细胞的迁移侵袭能力有明显的抑制作用,且具有剂量效应关系。其余四个抑制剂对肺腺癌A549细胞的迁移侵袭能力也具有不同程度的抑制作用;3.CZh226是通过抑制PAK4激酶的活性以及PAK4下游细胞骨架相关靶蛋白的表达来抑制微丝的重组,从而抑制肺腺癌A549细胞的迁移及侵袭能力;4.CZh226具有良好的大鼠微粒体代谢稳定性和血浆稳定性;通过静脉注射在大鼠体内具有较好的半衰期及药物暴露量。