为保证临床用血安全,血液在经采集进入血库前要经过严格检测。人类获得性免疫缺陷综合症、乙型肝炎、丙型肝炎以及梅毒作为血液筛查的常规项目,通常要经过严格的初筛和复筛,使用两种不同厂家的试剂由不同的检测人员进行两次检测,且两次结果均为阴性的血液标本方可入库。引起这四种疾病的病原体HIV、HBV、HCV以及梅毒螺旋体若进入血液对人体健康危害极大,成为严重威胁输血安全的潜在因素,因此如何有效控制和预防血源性传染病在人群中的扩散和传播至关重要,而严格筛查血源及血制品中的病原体则成为最为关键的一个环节。目前针对上述病原感染的检测手段主要依赖于免疫学和分子生物学方法。免疫学诊断的方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA),这种方法不能检测出处于窗口期及新近感染病毒的血标本,造成漏检率高。以核酸检测技术为代表的分子生物学检测方法虽然可缩短窗口期,但费时耗力,检测效率较低。基因芯片技术具有高通量、早期诊断以及自动化的特性,能对多病原体同时进行检测,利用该技术进行大规模初筛不仅可以显著提高采血机构检测效率,而且对于控制传染性疾病的传播提供了重要保障。然而基因芯片的临床应用尤其是多病原的联合检测仍然面临着一些问题,其中包括芯片的质量控制以及不同核酸(DNA、RNA)样品的标记。本研究针对这两个问题进行了如下探索,研究内容分为三部分。第一部分提出了一种新型寡核苷酸探针的设计与有效的芯片质控方法。新型探针设计方法介绍如下：在前期实验筛选得到的HIV探针中,本研究选取其中两条,取其核心部分50mer或60mer,在其两端或一端分别加上一段10mer的碱基序列(相当于一个通用序列标签,universal sequence tag, UST,与第二套通用引物部分互补的序列),设计出18条长度在60mer或70mer的寡核苷酸探针,同时将不加连接臂的该两条探针作为实验的阴性对照。UST可分为三种方式,分别为通用引物近5’端互补序列、中间互补序列以及近3’端互补序列。将探针打印于环氧基包被的芯片表面后,以Cy5标记的通用引物(Cy5-universal primer, Cy5-UP)与该芯片杂交,筛选出荧光信号值高于1000、信噪比(signal-to-noise ratio, SNR)高于4的探针(满足条件之一设为阳性探针)。从芯片的杂交结果中初步筛选了五条探针(1、8、9、10、12号)。进一步将经过筛选的5条探针重新打印,19号探针作为阴性对照,点样液作为空白对照,分别以荧光标记的通用引物(Cy5-UP)与随机引物(Cy5-random primer, Cy5-RP,9mer)与芯片杂交,以比较两种质控方法的检测效果。将通用引物与随机引物分别倍比稀释至20μmol/L、2μmol/L与0.2μmol/L,与2×杂交缓冲液混合点样。杂交洗脱经扫描后分析其荧光信号值及SNR可知,当采用20μmol/L与2μmol/L的通用引物杂交时,通用引物杂交的荧光信号值明显强于随机引物；当浓度降至0.2μmol/L时,随机引物杂交基本无荧光信号值,而通用引物杂交的8号探针仍显示出较强信号,说明了利用通用引物来检测芯片质量的优越性；同时筛选出了信号强而稳定的最佳UST为8号探针,它的连接方式是在探针的两端各加上10mer的近5’端互补序列(UST序列为：5’-TATGACTCAG-3’),且该序列与5’端相隔两个碱基；其次信号也较强的1号探针(UST序列与8号探针相同、只连接在靶基因探针5’端)可作为备选方案。考虑探针合成的成本与检测效率,本研究以1号探针UST设计的方案进行后续实验。为了验证这种新型探针的稳定性,以HBV基因为研究对象,设计了13条寡核苷酸探针,将1号UST连接在了所设计的13条HBV探针的5’端。采用Cy5-UP与探针杂交,结果显示1号UST标签与通用引物的杂交结果信号稳定,荧光信号值较强,可作为下一步联合检测寡核苷酸芯片设计及质量控制的选择方案。由此可知,本部分设计了一种新型寡核苷酸探针,并建立了一种与之匹配、有效的芯片质控方法。本研究第二部分探索了通用引物联合标记法(universal primer labeling, UPL)在DNA样品标记中的应用。芯片杂交检测过程中,样品的荧光标记是极其关键的一个步骤,快速有效的标记技术将对基因芯片技术的应用和推广产生重要的实用价值。限制性显示(restriction display, RD)荧光标记技术是本实验室核酸标记的一项专利技术。RD技术已经被证实是一项有效的全基因组荧光标记方法,尤其适合于DNA样品的标记。采用RD-PCR技术对样品进行荧光标记扩增,是通过对限制性酶切片段连接接头后,以针对接头设计的通用引物,实现样品中全基因组的扩增标记。由于标记过程中涉及酶切、加接头、一至两轮扩增等步骤,操作较繁琐,临床应用时可能不易被技术人员掌握,因此,需要进一步探索新的优化方法。通用引物联合标记法UPL是本实验室的另一项专利核酸标记技术,该技术采用一种通用的随机引物USN2(在第一套通用引物US的末端加上两个随机碱基),在RNA逆转录合成cDNA第一链后加入USN2作为引物进行10个循环的第一轮PCR扩增,扩增后反应混合物中则出现5’端含有通用引物序列US的双链DNA片段,接着采用荧光标记的通用引物(Cy3-universal sequence, Cy3-US)对这些DNA片段进行第二轮扩增标记。由于其具有高效、简便的优点,UPL方法尤其适合RNA样品的标记,在RNA病原检测芯片中应用较多。由于联合检测的血液病原体中同时存在DNA病原体与RNA病原体,因此,联合标记DNA及RNA样品成为本研究需要解决的问题所在。本部分以RD荧光标记技术作为对比,探索UPL技术在DNA样品中的标记效率,为进一步联合标记奠定基础。首先以梅毒螺旋体的TP和POLA两个基因片段作为研究对象,利用前期实验筛选得到的11条探针制备芯片,对DNA片段分别进行UPL与RD标记后,与该芯片进行杂交。结果表明荧光信号值均强而稳定,计算探针真阳性率可知二者标记效果无明显差别。由此得出,使用UPL技术对DNA样品进行扩增可行且高效,同时由于UPL技术中省去了酶切及加接头等步骤,操作流程更为简单方便,为后续UPL的推广使用奠定了坚实的基础。由于采用UPL对DNA样品进行标记后,扩增出大小在200bp-1000bp的若干DNA片段。为进一步验证扩增片段与探针之间是否具有对应性(即优势扩增探针匹配的靶基因),选取TP基因的第二轮UPL扩增产物,进行分子克隆及转化实验,挑出100个克隆进行PCR鉴定,结果表明DNA片段大小与扩增标记时一致。USN2末端的碱基与Sau3AI的GATC酶切位点相同,而该位点在碱基序列中的存在规律理论上是每256个碱基存在一个该位点,因此进行扩增后的DNA片段基本位于此范围内,鉴定结果与预期相符合。由此可知,使用UPL技术对微量的DNA样品进行扩增高效可行,且操作步骤简单,可用于后续病原体的微量扩增。在建立新型探针及质控方法、UPL联合标记技术的基础上,本研究第三部分制备血液病原联合检测芯片,并应用于小样本的临床样品检测,进一步验证上述联合检测芯片技术的可靠性。首先将第一部分设计好的13条HBV探针打印于环氧基玻片表面,使用UPL标记HBV的质粒Bj58及血清样品。标记后的样品分别与芯片进行杂交,筛选出阳性探针6条,用于后续联合检测。其次,将UST标签的新型探针方式用于HIV、HCV及梅毒探针的设计,其中,梅毒探针采用第二部分筛选得到的探针6条,HIV和HCV探针分别采用本实验前期临床实验筛选确定的探针,各6条。将上述探针加上阳性、阴性对照打印于同一张芯片制备联合检测芯片。采集经临床确诊的乙肝、丙肝及梅毒血清样品,正常人血清样品用作阴性对照,以及模拟HIV感染的质粒样品。分别提取其DNA或RNA,经UPL方法进行扩增标记后,与芯片进行杂交反应。小样本的临床样品结果初步显示,制备的联合检测芯片质量可靠,UPL标记方法有效,四种病原体的基因检测均较敏感,特异性高。综上所述,本研究建立了一种新型寡核苷酸探针及有效的芯片质控方法,探索了通用引物联合标记法在DNA样品标记中的应用,最终制备了血液四种病原联合检测的寡核苷酸芯片,通过临床小样本血清样品的检测进一步验证了这种新型质控方法以及标记方法的可行性,为联合检测芯片应用于临床用血四项常规项目的大规模临床实验奠定了坚实的基础。