论文部分内容阅读
急性肝炎作为临床上一种常见病症,其危害极其严重。然而到目前为止,其致病机制还不是很清楚。动物模型是研究该病的重要工具。脂多糖/D-氨基半乳糖胺(Lipopolysaccharide/D-galactosamine, LPS/D-gal)诱导的实验小鼠急性肝炎模型是目前应用比较广泛的动物模型,其能够较好地模拟病毒性肝炎等急性肝炎的致病过程。对于该模型的一些研究表明LPS与D-gal在体内是通过不同的机制参与急性肝炎的致病过程,然而其具体机制还有待进一步的研究。因此,深入研究LPS与D-gal各自在其中发挥的作用具有重要意义。另外,研究表明LPS/D-gal致病过程主要涉及到炎症反应和细胞凋亡,据报道mTOR信号通路在这两个病理过程中发挥重要作用。因此,探索mTOR信号在此疾病模型中变化对于认识急性肝炎的致病机制和抗肝炎药物的研发具有一定的理论价值。本论文主要分为三部分。首先是建立急性肝炎模型。以ICR、FVB、C57BL6三种不同品系小鼠作为实验对象,研究LPS/D-gal诱导急性肝炎的最佳药物剂量以及性别差异对模型建立的影响。并以ICR小鼠为代表进行LPS/D-gal诱导的急性肝炎模型建立的相关指标评价,以及对LPS/D-gal作用不同时间点进行动态分析。其次,以ICR小鼠为实验对象,对LPS与D-gal在该疾病模型中的作用机制进行了探索：(1)分别用LPS或D-gal单独诱导实验小鼠,研究它们各自在急性肝炎致病过程中的作用；(2)利用LPS预处理D-gal致敏的实验小鼠,观察小鼠存活情况,分析LPS预处理改变存活率的原因；(3)实验小鼠经D-gal致敏后,再用LPS进行诱导,分析D-gal在体内代谢的时间,以及一定程度的肝损伤对LPS作用的影响。最后,我们通过免疫印迹分析了mTOR信号途径在LPS/D-gal诱导的急性肝炎中的变化,并通过抑制mTOR途径来研究其在LPS/D-gal诱导的急性肝炎中可能发挥的作用。通过上述实验我们得到以下结果：(1)一定剂量LPS/D-gal联合作用均可引起ICR、FVB、C57BL6三种不同品系小鼠产生致死性的急性肝炎,死亡时间均发生在6h以后。经过比较性别差异发现雌性小鼠对LPS/D-gal联合作用反应更敏感。急性肝炎相关指标检测结果发现：ICR雌性小鼠经LPS/D-gal处理后6h,血清中转氨酶水平显著升高这说明肝脏组织受到了严重的损伤,病理切片结果确认了肝组织损伤。我们还发现炎性细胞因子TNFα、IL1β、IL6的mRNA表达水平显著升高,凋亡相关蛋白Caspase3被激活和裂解,NF-κB信号途径和mTOR信号途径均被激活。这些结果表明我们通过LPS/D-gal成功地诱导了ICR小鼠的急性肝炎及肝损伤。(2)LPS或D-gal单独作用均不能导致实验小鼠死亡。LPS作用主要诱导了炎性因子TNFa及抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达。前者主要引起炎症反应发生和诱导细胞凋亡,后者则发挥抗凋亡和肝细胞保护作用。而抗炎因子IL10的mRNA表达水平显著升高以及NF-κB信号途径被抑制表明LPS可能通过激活抗炎反应阻止炎症反应的过度发生。另外,免疫印迹分析发现,单独的LPS可以诱导激活mTOR信号途径。D-gal作为RNA合成的类似物抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl的mRNA表达,诱导肝脏组织细胞凋亡。进一步的免疫印迹检测结果表明,在D-gal作用6h后IκcBa水平下降,表明NF-κB途径被激活,但炎性因子TNFa的mRNA表达水平则没有明显变化,表明NF-κB途径可能在其中发挥其它作用。接下来,我们探讨了LPS在D-gal致敏小鼠前后的作用。我们发现在LPS预处理1h内,炎性因子TNFa和抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达水平均逐步升高,抗炎因子IL10的表达水平则没有明显变化。存活率分析发现,LPS提前1h预处理D-gal致敏小鼠,对小鼠有一定的保护作用。而小鼠经D-gal致敏后,LPS则能加速小鼠死亡。(3)免疫印迹分析表明,mTOR信号的激活与LPS/D-gal诱导的急性肝炎有一定的相关性。意想不到的是,mTOR的抑制剂Rapamycin尽管能够抑制mTOR信号,但并不能有效降低LPS/D-gal诱导急性肝炎的小鼠死亡,这提示mTOR信号在LPS/D-gal诱导的急性肝炎中可能起多重作用。综上所述,本研究通过LPS/D-gal成功地在3种不同品系的小鼠中诱导了急性肝炎,找到了适合于每一种小鼠的最佳LPS/D-gal使用剂量,并且还发现性别影响实验小鼠对LPS/D-gal的敏感性,雌性小鼠是建立该模型理想的实验动物。在LPS/D-gal诱导ICR雌性小鼠急性肝炎中,LPS的主要作用是促使炎性因子的大量表达,介导炎症反应的进程,在后期LPS也激发了抗炎反应。LPS诱导的炎性因子TNFa可能通过激活细胞内死亡受体诱导肝细胞凋亡,然而LPS同时激活了NF-κB信号通路启动抗凋亡的保护机制,因此单独使用LPS不能引起明显的细胞凋亡。D-gal通过抑制抗凋亡蛋白的合成,从而增加肝细胞对LPS诱导分泌的TNFa的敏感性,导致细胞凋亡。最后,在LPS/D-gal诱导的急性肝炎模型中mTOR信号途径被激活,然而其在此过程中发挥的作用还有待进一步研究。