论文部分内容阅读
芋螺毒素(CTx)是由芋螺毒腺管分泌的一类具有生物活性的小肽,富含二硫键,能特异性地作用于多种离子通道(Na+、K+、Ca2+等)和膜受体,具有很高的神经药理学研究价值。有显著镇痛活性的芋螺毒素,如MVIIA,已用于临床。目前保守估计全世界有5万种芋螺毒素,但仅有少数毒素的功能得到鉴定,我国丰富的芋螺毒素资源亟待丌发。本课题旨在通过化学合成和基因工程两种途径获得新的芋螺多肽,测定其二硫键连接方式,并对部分多肽的镇痛活性进行初步评价,为后续多肽的功能鉴定及构效关系研究奠定基础。具体工作如下：(1)采用Fmoc-固相肽合成法合成了25条芋螺多肽线性肽：conantokins(4条),αα-芋螺毒素(15条)和M超家族多肽(6条)。然后利用空气氧化折叠法获得含二硫键的芋螺毒素,除M族部分芋螺毒素因结构原因无法得到正确折叠产物外,其余多肽均有主产物生成,质谱鉴定分子量正确。两步氧化折叠及HPLC共洗脱结果显示所测定的α-芋螺多肽折叠主产物的二硫键连接方式为(Cys 1-Cys3, Cys2-Cys4),与已报道的天然α-芋螺多肽的二硫键框架一致。(2)利用大鼠坐骨神经半切模型(PSL)对liu-5、liu-6、liu-7、liu-16、liu-21和T4等6种α-芋螺多肽的7个折叠主产物的镇痛活性进行了评价。结果显示除liu-6、liu-7没有明显镇痛活性外,其它折叠产物都表现出较强镇痛活性,且效果较阳性对照Vcl.1持久。给药剂量为3 nmol/只时,给药1.5h后liu-5可使大鼠痛阈提高约97%,远高于Vcl.1；a4/7-liu-16和α4/8-T4的镇痛活性略低于Vcl.1。(3)采用融合蛋白表达体系对芋螺毒素的表达条件进行探索。将目的基因插入载体pGEX-6p-1,与GST融合表达。诱导条件经优化后(IPTG终浓度0.5 mM,23℃诱导8h),可溶性融合蛋白表达量可达12-15 mg/L培养物,亲和层析后获得与理论分子量一致的高纯度GST融合蛋白。酶切后生成多个小分子量片段。定性分析及分离纯化工作仍在继续。