目的:本试验通过建立微宇宙,观察微宇宙中较低浓度的氮磷营养盐对大肠杆菌耐药表型和生物膜形成能力的影响,以及大肠杆菌生物膜形成过程中有关基因(luxS、mqsR和运动性基因flhD、fiA、motA,以及I型菌毛基因fimH)的相对表达量,确定在氮磷营养盐条件下大肠杆菌生物膜形成与细菌耐药的相关性。方法:根据本课题组之前所获得的试验结果及微宇宙中总氮(TN)、总磷(TP)的基底值,设置了空白组和处理组(其中,处理组包括4个添加了较低浓度的氮磷营养盐的剂量组),每个组设置两个重复。测定水质指标中的TN、TP浓度及高锰酸盐指数(CODMn),观察其变化情况;采集并分离纯化大肠杆菌样本,然后用CLSI推荐的微量肉汤稀释法检测大肠杆菌对7种抗生素的耐药情况;采用定性检测(玻璃试管法)和半定量检测样品菌生物膜的形成能力,了解较低浓度氮磷营养盐对大肠杆菌生物膜形成的影响;最后利用实时荧光定量PCR检测大肠杆菌生物膜6个相关基因mRNA的表达水平,探讨其与大肠杆菌生物膜形成的相关性。结果:(1)添加较低浓度的氮磷营养盐后,微宇宙中的TN浓度总体来看变化不明显;TP浓度在加入氮磷后不久所有剂量组均降至基底值水平;各剂量组的CODMn在整个试验过程中没有规律性变化。药物敏感性试验结果显示,空白组没有分离到耐药菌株,各处理组的耐药率及多重耐药率均很高,其中中剂量组的整体耐药率最高,其次是高剂量组,最低剂量组和低剂量组的耐药率最低。各处理组主要是对头孢唑啉和氨苄西林的耐药(耐药率大部分在50%-100%的范围内),其次是头孢噻肟(耐药率大都低于50%);而最低剂量组、中剂量组和高剂量组分离获得的菌株中均被检测出对四环素的耐药,高剂量组更是出现了对氯霉素的耐药,但对这两种抗生素的耐药率都比较低。(2)在添加氮磷营养盐后,定性检测生物膜形成情况的结果显示,中剂量组形成的生物膜较其它组明显,其次是低剂量组和高剂量组,最低剂量组形成的生物膜是最不明显的。半定量试验的结果显示,中剂量组分离到的大肠杆菌的整体粘附能力最强,其次足高剂量组,再是低剂量组和最低剂量组。结合所选取样品菌的耐药情况可以发现:细菌耐药,形成的生物膜就比较明显;相反,细菌不耐药,形成的生物膜就比较不明显。(3)分别以第0 d和空白组采集的样品作为校准样品,将实时荧光定量PCR检测结果进行计算。结果均显示了各处理组在加入氮磷营养盐后的第1 d开始luxS、flhD、fliA、motA和fmH基因就出现了相应的表达,区别在于表达水平的高低以及表达持续时间的长短,而mqsR则基本不表达。此外,fhD、fliA、motA和fmH基因的表达水平变化趋势基本一致,其中fiA和motA的总体表达水平最高,其次是fimH,最后则是fhD。结论:(1)添加较低浓度的氮磷营养盐,可以导致微宇宙中分离到的大肠杆菌出现较高水平的耐药,甚至是多重耐药。中剂量组的氮磷营养盐浓度(TN和TP终浓度分别为3.5 mg/L、0.35 mg/L)对大肠杆菌耐药性的产生影响最大。(2)低浓度氮磷营养盐对微宇宙中的大肠杆菌生物膜形成有明显影响。本试验中,细菌耐药与生物膜形成能力之间有直接的相关性。(3)添加较低浓度的氮磷营养盐后,微宇宙中大肠杆菌的生物膜形成能力增强,且与luxs、flhd、fliA、mottA和fimH5个基因有关,与mqsR无关。(4)在微宇宙中添加较低浓度的氮磷营养盐后,出现的大肠杆菌耐药与多重耐药和生物膜形成能力呈正比,而与鞭毛基因及菌毛基因的表达水平和维持时间呈反比。3个鞭毛基因和菌毛基因fmH的表达水平呈正相关。