研究背景和目的:血管受损出血后,机体立即启动凝血系统,通过内源性或外源性凝血级联反应产生凝血酶作用于纤维蛋白原生成纤维蛋白,使血液从流动状态变为凝胶状态,从而达到止血的作用。整个过程需要凝血、抗凝以及纤溶系统共同参与。生理情况下,机体的这三大系统包含血小板、红细胞、白细胞、血管内皮细胞等多种细胞参与,受多种凝血因子、凝血相关蛋白调控保持动态平衡[1]。凝血过程中任何一个环节发生紊乱都可能导致异常的出血或血栓性疾病,如20%-50%的脓毒症病人有明显的弥漫性血管内凝血（Disseminated intravascular coagulation,DIC）[2]。此外,严重创伤[3]、肝功能障碍[4]、恶性血液病[5]等都伴有一定程度的凝血异常。因此研究凝血过程中的分子机制无疑将有助于为许多伴有凝血障碍疾病的防治提供新靶点。血管内皮细胞覆盖在所有血管的表面,为循环血液、间质的细胞和非细胞成分提供了重要的屏障,起着调节组织灌注,供氧和运输营养物质,控制血压的作用。此外,内皮细胞作为连接凝血、抗凝血和纤维蛋白溶解的桥梁,在止凝血的促凝、抗凝及纤溶过程中也发挥极为重要的作用[1]。机体血管受损,内皮细胞通过高表达组织因子（Tissue factor,TF）和血友病因子（von Willebrand Factor,v WF）,分别启动外源性凝血途径和活化血小板而发挥促凝作用[6];内皮细胞也分泌抗凝血酶（Antithrombin,AT）、血栓调节蛋白（Thrombomodulin,TM）、蛋白C受体等参与抗凝过程;此外,内皮细胞也通过表达组织型或尿激酶型纤溶酶原激活物（Tissue/Urokinase plasminogen activator,t-PA/u-PA）和纤溶酶原激活物抑制剂（Plasminogen activator inhibitor,PAI-1）参与调控血栓的溶解[7,8]。既往研究表明,血管内皮细胞参与止凝血平衡受转录和转录后机制如转录因子、micro RNA等调控[9,10]。近年来mRNA转录后修饰被报道在许多领域发挥着重要作用,N6甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）是真核生物mRNA最普遍的转录后修饰,m6A修饰由甲基转移酶复合体催化形成,其中甲基转移酶样蛋白3（Methyltransferase-like 3,METTL3）是复合体的核心亚基[11]。研究表明,METTL3在胚胎造血内皮细胞中影响内皮细胞的生成[12]。在肝细胞癌和前列腺癌中,METTL3影响凝血通路[13]。既然METTL3在内皮细胞中高度富集,而内皮又是凝血调控的主要参与者,那么METTL3是否参与调控内皮细胞止凝血过程,值得进一步研究。为探究METTL3在内皮细胞参与的止凝血中的作用,我们首先构建METTL3基因沉默的人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）模型,利用转录组测序探究METTL3是否调控内皮细胞介导的止凝血过程。研究发现METTL3与止凝血密切相关,METTL3促进抑制纤维蛋白溶解的关键分子PAI-1的表达,功能实验进一步证明METTL3抑制纤维蛋白溶解。接着通过构建基因沉默、过表达和回补的HUVEC细胞模型对METTL3调控PAI-1的分子机制进行探究。最后采用脓毒症小鼠模型在体内初探了METTL3对PAI-1的调控作用。主要研究结果如下:一:METTL3上调血管内皮细胞PAI-1的表达抑制纤维蛋白溶解1.METTL3参与调控内皮细胞介导的止凝血过程首先利用慢病毒介导的shRNA（Short hairpin RNA,shRNA）感染HUVEC,通过定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR,qPCR）和免疫印迹实验（Western blot,WB）证实了METTL3基因沉默的细胞模型构建成功。随后抽提METTL3基因沉默的HUVEC细胞RNA,进行高通量转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）及生物信息学分析,差异基因聚类分析结果提示沉默METTL3后,诸多生物学过程如止凝血和细胞迁移等受到显著影响。METTL3在细胞迁移中的作用研究见附录,本研究着重探讨METTL3在内皮细胞介导的止凝血平衡中的作用。进一步差异基因热图分析发现抑制纤维蛋白溶解的关键分子PAI-1的表达水平显著下调。2.METTL3上调PAI-1的表达为了对生物信息学的结果进一步进行验证,我们采用qPCR和WB在沉默METTL3的HUVEC中检测PAI-1的表达水平,发现PAI-1的表达水平显著下调（P<0.001）。随后我们构建METTL3基因过表达和回补的HUVEC细胞模型,采用qPCR和WB检测PAI-1的表达,发现PAI-1的mRNA和蛋白表达水平显著上调（P<0.001）。以上结果表明METTL3促进PAI-1的表达。3.METTL3抑制纤维蛋白溶解PAI-1是纤维蛋白溶解重要的调控因子,为了明确METTL3在纤维蛋白溶解过程中的调控作用,我们采用纤维蛋白溶解实验分别在METTL3沉默、METTL3过表达、METTL3回补HUVEC细胞观察纤维蛋白溶解情况,结果发现纤维蛋白溶解在METTL3沉默的细胞中加快,在METTL3过表达的细胞中显著减慢,而在回补METTL3后纤维蛋白溶解速度得到加快,表明METTL3抑制纤维蛋白溶解。二:METTL3促进PAI-1表达依赖于m6A-JUN-YTHDF1通路1.JUN mRNA富含m6A修饰位点为了探索METTL3调控PAI-1的分子机制,首先将HUVEC中被m6A修饰的mRNA先进行m6A富集,后进行甲基化RNA免疫共沉淀测序（RNA Immunoprecipitation sequencing,RIP-seq）。结果发现PAI-1的mRNA无明显甲基化修饰,而转录因子JUN mRNA上高甲基化修饰。2.METTL3通过介导JUN mRNA的m6A修饰促进其翻译为了验证METTL3甲基化修饰JUN mRNA,我们在沉默METTL3的细胞中采用RIP-qPCR检测JUN mRNA上的m6A修饰水平,结果发现JUN的m6A修饰水平显著降低（P<0.05）,提示METTL3甲基化修饰JUN。为了进一步探索METTL3甲基化修饰JUN mRNA后对其基因表达的影响,我们在沉默或过表达METTL3的HUVEC中采用qPCR和WB检测JUN的mRNA或蛋白表达,结果发现沉默或过表达METTL3对JUN mRNA的表达量无明显影响,却分别显著下调和上调了JUN的蛋白表达水平。以上结果表明METTL3介导JUN甲基化修饰影响JUN翻译。3.JUN蛋白促进PAI-1基因转录为了探索JUN能否调控PAI-1的转录,首先采用染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,Ch IP）检测JUN与PAI-1启动子区的结合情况,结果发现JUN可结合到PAI-1启动子区。接着我们在沉默或过表达JUN、METTL3沉默后过表达JUN的HUVEC中采用qPCR和WB检测PAI-1的表达水平并进行纤维蛋白溶解实验。结果发现在JUN沉默或过表达的细胞中PAI-1的表达分别显著下调（P<0.001）和上调（P<0.01）;过表达JUN能在METTL3沉默的细胞中补救PAI-1的低表达（P<0.001）;纤维蛋白溶解速度在JUN沉默后减慢,在JUN过表达后显著加快,过表达JUN能在沉默METTL3的细胞中补救纤维蛋白溶解受损的表型。以上结果表明JUN促进PAI-1转录从而抑制纤维蛋白溶解,METTL3促进PAI-1的表达依赖于JUN。4.JUN介导的PAI-1表达上调依赖识别蛋白YTHDF1被m6A修饰后的mRNA由不同的m6A识别蛋白识别从而调控mRNA的表达。结合前述METTL3促进JUN翻译的结果,因此我们构建促进翻译的m6A修饰识别蛋白YTHDF1沉默的HUVEC细胞模型,采用WB检测JUN/PAI-1的表达水平。结果发现JUN蛋白表达水平显著下调;PAI-1的mRNA和蛋白表达水平均显著下调（P<0.05）。表明JUN mRNA的m6A修饰是由YTHDF1所识别的,JUN促进PAI-1的表达依赖于YTHDF1。三:METTL3/m6A/JUN/PAI-1通路与调控脓毒症纤维蛋白沉积的关联性1.脓毒症小鼠血管纤维蛋白沉积为了研究METTL3在体内对PAI-1表达的调控作用,我们通过6mg/kg LPS腹腔给药处理C57/BL6小鼠建立脓毒症小鼠模型。4h后取肺、肝组织,采用免疫组化和苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosin,HE）分别检测其中纤维蛋白沉积和血栓形成情况。结果发现脓毒症小鼠肝、肺组织有明显的纤维蛋白沉积和血栓形成。2.脓毒症小鼠血管纤维蛋白沉积呈现METTL3/m6A/JUN/PAI-1通路高表达我们收集脓毒症小鼠及对照组的腹腔静脉和胸主动脉,采用m6A甲基化测定试剂盒检测m6A修饰水平,采用qPCR和WB法检测METTL3/JUN/PAI-1的表达水平,结果发现与对照组相比,脓毒症小鼠血管中m6A修饰水平显著升高（P<0.05）,METTL3/JUN/PAI-1的表达水平均显著上调（P<0.01）。主要结论:通过本研究,我们得到以下结论:（1）METTL3参与调控内皮细胞介导的止凝血功能,通过上调PAI-1的表达抑制纤维蛋白溶解。（2）机制方面,METTL3通过m6A-JUN-YTHDF1通路促进PAI-1的表达。（3）METTL3/m6A/JUN/PAI-1与脓毒症小鼠纤维蛋白沉积及微血栓形成相关,但仍需进一步实验证实。本研究揭示了METTL3调控纤维蛋白溶解的机制,为m6A修饰参与调控止凝血提供了实验依据,并为止凝血障碍临床防治提供了可能的新靶点。