杜泊绵羊作为优质的肉用品种深受养殖业青睐,但由于在日常生产中绵羊冷冻精液的受胎率普遍偏低制约了杜泊等优秀品种及其冻精产品的推广与普及。冷冻过程会给精子带来一系列影响及损伤,有研究表明冷冻会使精子的结构和功能发生改变,损伤头部的质膜以及顶体,尾部的鞭毛和轴丝等结构,这些影响和损伤可能是导致冷冻精子受胎率偏低的部分原因。但目前对于冷冻精液质量相关的研究大多集中在冻融形态学变化、改善外部储存条件及优化保护剂配比等方面,对于精子冷冻后受胎率下降的内在机制研究尚不深入。随着蛋白组学研究方法的不断进步,为深入研究精子冷冻后受胎率下降的内在机制带了新的机遇。本实验将提取到的鲜精、冻精总蛋白进行SDS-PAGE电泳,将差异明显的蛋白条带通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行鉴别,共得到489种蛋白,通过参考相关文献、生信分析(质谱结果分析、GO分析、KEGG分析)等方法筛选出几种可能与绵羊冷冻精子质量相关的蛋白,并对其基因进行相对表达量测定。本实验的研究目的在于为今后进一步揭示绵羊精子冷冻凋亡或损伤的内在机制提供部分理论依据。1.分别对冻精与鲜精进行精子活率测定,利用伊红活体染色联合低渗肿胀实验对两组精子进行质膜完整性检测。结果表明相对于鲜精,冻精的精子活率以及质膜完整性均发生极显著(P<0.01)地降低。2.将提取到的冻精、鲜精总蛋白进行SDS-PAGE电泳,电泳结果显示冻精组与鲜精组在100KDa、20KDa、14KDa位置差异极显著,切取上述三处位点的胶条进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)鉴别,将得到的489种蛋白通过质谱结果分析、生物信息学分析等方法,最终筛选出5种可能与冷冻精子质量存在相关性的蛋白(Tubulin alpha chain、Tubulin beta chain、Tektin 5、Outer dense fiber of sperm tails 2、Hexokinase 1)。3.以GAPDH为内参通过荧光定量PCR对上述5种蛋白对应的基因进行相对表达量测定,结果表明相对于鲜精,该5种基因冷冻后的相对表达量均表现为不同程度的下调。结论:精子的活率、质膜完整性及综合质量,与上述蛋白对应基因的表达量呈正相关。