慢性疼痛是指由组织损伤,包括物理创伤、各类炎症以及自身免疫等原因引起的持续性疼痛,常表现为包括损伤部位及其投射区在内的广泛区域的疼痛、痛觉敏感和感觉异常。疼痛信号被外周感受器感受通过痛觉传导通路最终投射到皮层相关区域产生痛觉。慢性疼痛的发生主要是由于受到反复伤害性刺激使痛觉传导通路上神经元功能改变,包括神经元的异位放电、神经递质的大量释放和突触长时程增强等。然而,大量的证据提示疼痛尤其是慢性疼痛的产生不只是与神经元的活动有关,神经系统的另一类细胞-神经胶质细胞也发挥了重要作用,而神经元的功能改变与神经胶质细胞的活化密切相关。中枢神经系统主要由神经元和各类胶质细胞组成,且胶质细胞的数量远大于神经元。传统理论认为,胶质细胞主要起支持、保护、营养和免疫等作用。即神经元是神经系统内参与神经功能活动的主体细胞。胶质细胞只对维持神经元的各项活动起支持作用。但是,随着对胶质细胞研究的不断加深,越来越多的资料表明,胶质细胞不仅仅是参与神经系统的生理或病理活动,而是在其中发挥了重要作用。在中枢神经系统中,神经胶质细胞主要包括星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞,其中小胶质细胞被认为是神经系统内的免疫细胞,参与神经系统的修复、免疫活动和炎症反应。近几年的研究发现,小胶质细胞的激活与各类神经、精神疾病,如神经退行性疾病PD、AD和抑郁症等密切相关。此外,研究还发现脊髓小胶质细胞与慢性疼痛的发生密切相关。在痛信号产生的初始阶段,就伴随有小胶质细胞的活化,包括明显的形态结构变化以及各种细胞因子(TNF-α、IL-1β、BDNF)的释放、活性氧自由基的生成等等。这些物质会作用于神经元并影响其功能,其结果是强化痛信号的产生和传递。虽然大量证据表明活化的胶质细胞参与了疼痛信号的传递,但是胶质细胞如何被活化目前并不十分明确。由于神经元与胶质细胞同属一个神经网络,常规的疼痛研究实验体系(围绕神经元设计的实验体系)无法区分痛刺激对神经元及神经胶质细胞的单一效应,大大限制了对胶质细胞活化尤其是活化机制的了解。此外,由于痛信号主要是由各种神经递质传递,因此有必要观察神经递质对脊髓胶质细胞的活化作用及相关机制。传递伤害性信息进入脊髓的神经递质有ATP、谷氨酸、P物质和CGRP等。已有实验显示,ATP可通过小胶质细胞上的P2X4受体激活小胶质细胞,并且参与慢性疼痛的形成,而其它神经递质对脊髓小胶质细胞的活化及活化机制并不明确。P物质被认为是痛相关甚至是痛特异的神经递质,P物质属于肽类神经递质,介导外周伤害性信号由外周传入脊髓并参与脊髓内痛觉调制,其受体为NK-1受体。脊髓的小胶质细胞也表达有NK1受体,但是P物质对小胶质细胞的作用,如是否会直接刺激活化小胶质细胞,通过何种通路活化,以及其是否参与慢性疼痛目前尚不清楚。基于目前关于胶质细胞在疼痛过程中发挥作用的实验设计的局限性,我们采用了离体培养的胶质细胞,直接观察相关的生物活性物质如P物质等对胶质细胞的作用并分析其信号通路,同时设计在体实验即将活化的胶质细胞注入脊髓蛛网膜下腔观察其对脊髓水平痛信号产生的影响。希望通过离体和在体的实验观察提供P物质通过活化脊髓小胶质细胞参与疼痛的确切证据。目的：1、通过离体培养脊髓小胶质细胞观察P物质对小胶质细胞的活化作用,包括细胞形态学观察和对TNF-α、IL-β释放量的检测。2、通过P物质作用于离体培养的脊髓小胶质细胞,观察小胶质细胞胞内信号分子的变化。3、利用痛行为检测的方法观察经P物质刺激活化的小胶质细胞对动物痛行为的影响。方法：1、取出生24h以内的SD大鼠脊髓原代培养脊髓小胶质细胞。将培养的小胶质细胞分为4组：(1)空白对照组,细胞孵育全培液；(2)P物质200μM组；(3)P物质400μM组；(4)P物质800μM组；各组细胞分别孵育2h、6h、12h、24h后进行后续实验。2、采用免疫细胞化学法鉴定OX-42阳性的小胶质细胞,并观察P物质孵育后小胶质细胞的形态改变。3、采用ELISA的方法检测P物质孵育后小胶质细胞对TNF-α和IL-p的释放情况。4、利用激光共聚焦显微镜胞内钙离子成像技术观察P物质孵育后小胶质细胞胞内Ca2+浓度变化。5、采用免疫荧光双标的方法观察P物质孵育后小胶质细胞胞内p38MAPK的磷酸化水平。6、将体外P物质预先孵育的原代小胶质细胞鞘内注射至SD大鼠腰膨大部位蛛网膜下腔,测定注射前、注射后6h、12h、24h大鼠的痛行为改变,以缩足反射潜伏期(PWL)为指标,观察P物质活化的小胶质细胞对大鼠痛行为的影响。结果：1、经OX-42免疫细胞化学方法鉴定,培养细胞为小胶质细胞,DAPI复染,证实细胞纯度达95%以上。2、以全培液为空白对照,P物质200gM孵育后,细胞形态与空白对照几乎没有差别。P物质400μM组细胞胞体变大变圆,细胞形态保持完整,随观察时间延长,OX-42免疫染色增强。P物质800μM组细胞OX-42免疫染色增强,但多数细胞形态并不完整。3、TNF-a的检测结果显示,P物质200μM组在4个时间点与空白对照组相比,均无统计学差异。P物质400μM和800μM组从6小时开始,TNF-α释放量明显增加(分别为276.63±15.3和447.57±19.36),12h达到高峰(分别为445.45±30.27和759.38±47.64),24h后浓度有所降低(分别为332.31±16.25和401.48±35.59),且8001μM组引起的释放量大于400μM组。4、IL-p的检测结果显示,P物质200μM组在4个时间点与空白对照组相比,均无统计学差异。P物质400μM组和800μM组从6h开始,IL-p释放量明显增加(212.64±15.01和414.69±20.74),12h达到高峰(分别为285.04±20.74和642.6±11.62),24h浓度有所降低(分别为223.97±4.73和367.33±13.42),与TNF-a的释放量类似,800μM组引起的释放量大于400μM组。5、胞内钙离子成像测定结果显示,P物质200μM或400μM孵育后均未能改变胞浆内Ca2+浓度。当P物质浓度达到800μM时,胞浆内Ca2+迅速降低,镜下观察发现部分细胞失去贴壁能力。6、P物质400μM孵育脊髓小胶质细胞15min后,胞内p38MAPK磷酸化水平明显升高。7、P物质400μM孵育12h预先活化的小胶质细胞注入成年SD大鼠脊髓蛛网膜下腔后,动物PWL减小,出现热痛觉敏感,并可持续至注射后24h。结论：1、P物质可以诱导脊髓小胶质细胞活化,其有效浓度为400μM,至少需持续作用6h。2、P物质可以诱导小胶质细胞p38MAPK的磷酸化,但未能升高小胶质细胞胞内钙离子浓度。3、P物质活化的脊髓小胶质细胞参与热痛觉敏感的形成。4、 P物质诱导脊髓小胶质细胞活化参与热痛觉敏感的形成可能与p38MAPK信号通路活化,并使细胞释放促炎因子TNF-α、IL-1β有关。