研究背景:　　 艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(Human Immune Deficiency Virus,HIV)引起的一种全身性免疫抑制疾病,以接近100％的高致死率严重危害着人类健康。但自1981年首次发现艾滋病以来,仍没有找到有效的预防措施,HIV继续以每日约8000个新增感染病例的速度在全球蔓延。值得强调的是,感染者中约有50％为女性,特别是在撒哈拉以南的非洲,女性感染率高达67％。在男性拒绝的情况下,一些诸如:避孕套,单性伴等预防性措施作用难以取得效果。这就急需一种具有女性自控性的预防措施出现,如杀微生物剂(Microbicide)。早在上个世纪90年代,“Microbicide"这个名词已经进入预防HIV的研究领域,特指在阴道或直肠局部使用的具有抗HIV和其他病原体作用的抗微生物制剂。迄今为止,还没有一个杀微生物剂产品正式上市使用,但杀微生物剂候选产品的研究已经进入了第三代。第一代杀微生物剂以非离子表面活性剂N-9(Nonoxynol-9)为代表,它是第一个进入临床研究的杀微生物剂。N-9在作为杀微生物剂进行研究之前,已经在临床上作为杀精子剂应用超过25年之久。由于价格便宜,而且在体外和动物模型的抗HIV实验中证明有效,N-9很快进入了预防HIV性传播的大规模临床试验,但因其损伤阴道上皮细胞,破坏粘膜组织完整性,非但没有降低反而增加了受试人员感染HIV的比率,因而最终退出杀微生物剂的行列。也正是N-9的失败,杀微生物剂对阴道的安全性评价越来越受人们关注,至今已经成为筛选杀微生物剂的首要条件。　　 目的:　　 1、通过对女性阴道内乳酸杆菌的收集,分离与纯化；鉴定出乳酸杆菌的菌种,而后将候选杀微生物剂对已鉴定的菌种进行药敏实验,来观察候选杀微生物剂对阴道乳酸杆菌的安全性。　　 2、通过对候选杀微生物剂进行抗HSV-2病毒实验,来观察候选杀微生物剂是否具有抗HSV-2病毒活性。　　 方法:　　 1.女性阴道内乳酸杆菌的样本收集,分离与纯化　　 在妇科门诊病人中,用无菌试管收集阴道分泌物,并在2h内将其转移到细菌室。将阴道分泌物接种在乳酸杆菌选择性培养基(MRS培养基)琼脂板上,并将接种板置于厌氧盒中,37℃恒温培养72h。72h后观察接种板的菌落生长情况,根据菌落生长的大小、形态、颜色、粗糙程度以及气味初步判断可疑菌株,并对可疑菌株进行涂片、革兰染色,并在油镜下观察其细菌的形态,染色情况；将革兰染色阳性,且形状为杆状的可疑菌落,进行触酶实验。将革兰染色阳性,触酶实验阴性的可疑单个菌落接种于另一新的MRS培养基琼脂板上,进行菌株纯化培养。培养条件仍为厌氧、37℃恒温。　　 2.阴道乳酸杆菌的生化鉴定　　 采用法国bioMérieux公司的API 50 CHL鉴定条码和API细菌鉴定系统,对阴道乳酸杆菌进行生化鉴定,方法依据该鉴定条码说明书。　　 3.阴道乳酸杆菌的分子鉴定　　 将冷冻于-80℃冰箱的阴道乳酸杆菌,迅速置于37℃水浴锅内,溶化复苏。然后将其加入到MRS Broth培养基中,封口,置于37℃恒温摇床中扩增。应用细菌基因组提取试剂盒对扩增后的细菌DNA进行抽提；将抽提的DNA进行浓度测定后,根据PCR反应试剂盒要求,进行DNA的PCR扩增；然后将PCR扩增产物进行凝胶电泳,电泳产物进行凝胶成像采集并根据需要将可疑条带进行割胶回收:根据凝胶回收试剂盒的步骤,对上述的胶条进行DNA回收；测定回收DNA浓度,并将其送测序公司进行测序。利用Vector NTI 8.0序列分析软件对各菌株进行菌种鉴定。　　 4.候选杀微生物剂对阴道乳酸杆菌的药敏实验　　 将分子鉴定为乳酸杆菌的菌株,进行复苏,扩增；测定扩增产物的麦氏度(MCF,用于测定细菌浓度的单位),然后将其稀释到0.5 MCF(利用MRS Broth培养基稀释)。将候选杀微生物剂按照浓度梯度,加入细胞培养用96孔板内,50μl/孔；再将上述稀释的0.5 MCF的细菌悬浮液继续以1:100的比例稀释,并将此悬浮液加入到上述装有候选杀微生物剂的96孔板内,50μl/孔。混匀后,将细胞板置于厌氧盒内,并将厌氧盒放在37℃恒温箱内,48 h后肉眼和镜下观察细菌生长情况,得出每种候选杀微生物剂对阴道乳酸杆菌的MIC(最低抑菌浓度),从而判断候选杀微生物剂对阴道乳酸杆菌的药物敏感性。　　 5.HSV-2病毒复苏,接种与培养　　 将Vero细胞接种到25 cm2培养瓶中,待细胞90％铺满瓶底部时接毒:将冻存于-80℃冰箱内的HSV-2病毒迅速在37℃水浴锅内溶化；弃细胞瓶内原有的培养基,PBS清洗一次；加溶化好的病毒液500μl,摇匀,5％CO2,37℃孵箱内培养1.5 h,每隔15 min摇匀一次；1.5 h后弃病毒液,PBS清洗一次,加病毒维持液；将此板置于5％CO2,37℃孵箱内培养,每日观察细胞CPE发展情况,待所有细胞都出现CPE时,收集病毒。　　 6.HSV-2病毒的收集与保存　　 将要收毒的细胞瓶反复冻融三次(必须在-80℃冰箱内反复冻融,因为此病毒不能保藏于-20℃)； 反复冻融后,用移液器吹打细胞,并将吹打完毕的细胞维持液,细胞一同转置15ml离心管,低温冷冻离心(4℃,4000 r/min,10 min)；将上清液转入冻存管内,直接置于-80℃保存。　　 7.HSV-2病毒滴度测定　　 细胞准备:Vero细胞以104/孔的浓度铺96孔板,过夜后细胞基本长满细胞板时实验；病毒稀释:用维持液将病毒10倍稀释,第一个浓度为10-1倍原液,而后依次稀释；弃细胞板中的原有培养基,PBS清洗一遍,加50μl/孔的维持液；将不同浓度的病毒稀释液加入装有维持液的细胞板内(每个浓度设6个复孔),50μl/孔；同时设定细胞组对照。将此板置于5％CO2,37℃孵箱内培养,每日观察细胞CPE的产生情况,72h后观察见有CPE出现的孔均为阳性；根据Reed-Munch公式计算 TCID50。　　 8.HSV-2病毒抑制实验CPE肉眼观察与MTT定量测定　　 铺Vero细胞到96孔板,104/孔,过夜培养；次日弃培养基,PBS清洗一遍,每孔加100个 TCID50的HSV-2病毒,50μl/孔；加2倍稀释的候选杀微生物剂(维持液稀释),每个浓度设3个复孔,50μl/孔；同时设定阳性对照药ACV组(阿昔洛韦,1μg/ml),维持液组,细胞组做对照。将此板置于5％CO237℃孵箱内培养,每日观察CPE现象,在维持液组(纯病毒组)的细胞100％CPE时,记录每孔CPE情况,肉眼观察候选杀微生物剂对HSV-2的抑制作用。待维持液组的细胞完全悬浮死亡时,记录结果并进行MTT测定:PBS现配现用MTT溶液,5 mg/ml,避光:向上述板内加入MTT溶液,10μl/孔,混匀,将细胞板置于5％CO2,37℃孵箱中培养4h；4h后离心(300 rcf,5 min),弃上清,加DMSO 100μl/孔,混匀后测定吸光度值(OD570)。　　 9.HSV-2病毒抑制时效实验　　 细胞准备,病毒配置,对照组设置与上述HSV-2病毒抑制实验方法一致；向该细胞板内加100 TCID50 HSV-2病毒,50μl/孔,细胞组除外；细胞组与维持液组分别加入维持液100μl/孔和50μl/孔；分别在加入病毒后的0 h,0.5 h,1 h,2 h,4 h,8 h加入各对应时间组的测定药物,50μl/孔；加药后培养,观察与MTT测定方法与上述HSV-2病毒抑制实验方法一致。　　 10.细胞毒性测定　　 铺Vero细胞到96孔板,104/孔,过夜培养；次日弃培养基,PBS清洗一遍,加50μl/孔维持液；用维持液将候选杀微生物剂稀释成不同浓度,50μl/孔,每个浓度设3个复孔；同时设细胞组做对照。摇匀后,将细胞板置于5％CO2,37℃孵箱中培养,72h后每孔加入5mg/ml MTT 10 μl,继续培养4 h,离心(300rcf,5 min),弃上清,加DMSO 100μl/孔,混匀,测定吸光度值(OD570)。　　 11.统计学分析　　 IC50和CC50的计算采用Calcusyn软件；做图依据的是GraphPad Prism 4.03(数据分析和作图软件)；所有数据采用SPSS 13.0软件包进行统计处理。　　 结论:　　 1.我国女性阴道乳酸杆菌的优势菌种很可能也包括卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)和格氏乳酸杆菌(Lactobacillus gasseri)。　　 2.以生理特性与生化反应为分析点的法国bioMérieux(生物梅里埃)公司研制的API 50 CHL鉴定条码体系,在鉴定乳酸杆菌时存在漏洞,鉴定结果与分子鉴定结果存在差异。　　 3.酸酐修饰蛋白类候选杀微生物剂HP-OVA,ML-OVA和HP-HSA与小分子HIV进入抑制剂90％TF和ADS-J1对阴道乳酸杆菌的体外生长影响较小,为其成为杀微生物剂提供了部分安全性依据。　　 4.酸酐修饰蛋白类候选杀微生物剂ML-OVA,HP-OVA和HP-HSA与小分子HIV进入抑制剂类候选杀微生物剂中ADS-J1均具有明显抑制HSV-2病毒作用,且对Vero细胞的毒性作用小,为其成为杀微生物剂提供了部分活性依据。