背景:Ⅰ型糖尿病(T1D)是一种常见的慢性自身免疫性疾病,是由于产生胰岛素的胰岛β细胞遭到识别自身抗原(如胰岛素)的自身反应性T细胞的免疫性破坏所致。胰岛β细胞的减少导致患者胰岛素绝对量减少,患者血糖水平逐渐升高,产生一系列并发症,如心脏疾病、休克和肾脏损害等。T1D多发生在儿童和青少年,通畅典型的症状是高血糖,当能明确诊断的时候,患者体内仅有有限数量的内源性胰岛素。必须通过规律地皮下注射外源性胰岛素来进行替代治疗以维持生命。此外,患者需要频繁检测血糖水平,以监测及防止高血糖及低血糖等危险发生。以监测及防止发生高血糖或者低血糖等危险。然而,注射外源性胰岛素来治疗糖尿病也存在各种不良反应,也不能控制并发症的产生。T1D使得临床患者生活质量下降,不断出现的并发症使患者痛苦不堪,甚至威胁患者生命。T1D是一种产生胰岛素的胰岛β细胞发生免疫破坏所致的疾病,因为缺少适合用于研究免疫机制的动物模型,该病的发病机制目前仍然不清楚。T1D患者胰岛炎性病变的典型特点是产生胰岛素的β细胞数量减少并且伴随着T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和较小的其他免疫细胞浸润到胰岛。T1D的发病机制可能因为自身反应性CD4 T细胞对胰岛β细胞细胞进行特异性的自身反应性破坏而启动了一系列的细胞免疫和体液免疫反应所致,但是迄今为止没有任何证据证实该发病机制。为了深入了解和研究该病的发病机制以及检测药物的临床治疗效果,建立合适的动物模型是非常必要的。数十年来已经有很多具有T1D综合症表现的动物模型被广泛用于该病的发病机制以及药物药效的研发。但是这些模型都或多或少存在一些缺陷,比如:就药效的研究来说,多数治疗方案虽然在动物模型上应用是有效的,但是应用到患者时则不能起到应有的作用。这其中一个最主要的原因就是,这些动物模型与人类疾病之间存在较大的差异,并不能完全模拟人类T1D的疾病特点。因此,建立一种更接近于人类T1D疾病动物模型才是最有价值的。提到与人类疾病最相近的动物模型就不得不说到人源化小鼠,人源化小鼠是具有人的基因、细胞或组织/器官的动物,它能够模拟人类体内病理和生理情况,被认为在不久的将来可以用于人类研究的最接近人类的、先进的动物模型。已有实验报道,以这种人源化小鼠为基础,通过转输T1D患者的外周血单个核细胞以及人的特异反应性自身免疫性T细胞给免疫缺陷小鼠来建立人源化小鼠,可以在小鼠体内诱导产生胰岛炎。但是很难避免转输的T细胞产生移植物抗宿主反应。此外,通过上述途径是无法成功建立持久的T1D综合症,如高血糖或者是胰腺胰岛的破坏,可能是由于输注的免疫细胞因为缺乏淋巴造血环境条件,如抗原提呈细胞等,而无法在受者小鼠体内长期存活。为此,建立具有人的免疫系统和造血系统的人源化小鼠的T1D模型是最适合进行人类T1D疾病的研究。此前,我们通过给NOD/SCID或者NSG小鼠移植人的胚胎肝脏细胞来源的CD34+细胞和同源的胚胎胸腺组织块,已经在这些免疫缺陷小鼠体内成功地构建了人的多系造血细胞以及具有正常免疫功能的免疫系统。因此,我们以具有人的免疫系统和造血系统的人源化小鼠为基础,给予基因工程改造后能够表达患者来源的胰岛自身反应性T细胞受体(TCR)的人的CD4 T细胞,以建立Ⅰ型糖尿病的人源化小鼠模型。并且通过该模型的建立,进一步明确自身反应性CD4 T细胞在人类T1D发生发展过程中的作用,为T1D病例机制的研究提供确凿的佐证。实验目的:本研究的目的是在具有人造血免疫系统人源化小鼠模型的基础上,通过输注同源的表达胰岛素自身抗原特异性TCR受体的人CD4T细胞建立Ⅰ型糖尿病人源化小鼠疾病模型,并以该模型研究人类自身反应性T细胞在人类Ⅰ型糖尿病发病的病理过程中的作用机制。实验方法:1.用基因工程的方法制备含HLA-DQ8限制性并能够特异性识别HLA-DQ8提呈Ins B9-23的TCR的慢病毒载体。慢病毒通过脂质体2000转染293T细胞的方法来制备。用不表达任何TCR的J.RT3-T3.5细胞系来验证此特异性TCR在T细胞中的表达。2.人源化小鼠的构建NSG小鼠、HLA-DQ8转基因的NOD/SCID和NSG小鼠先接受亚致死剂量(NSG和HLA-DQ8转基因NSG,1.25Gy;HLA-DQ8转基因NOD/SCID,1.5Gy)全身照射,然后接受静脉注射1×105人胚胎肝脏细胞来源的CD34+细胞和肾被膜下移植相同胚胎来源的1mm3的胚胎胸腺组织块。用流式细胞术(FCM)测定人源化小鼠中人的造血细胞重建的水平。3.慢病毒转染来自于人源化小鼠的人CD4~+T细胞通过磁珠阴性分选的方法得到人的CD4~+T细胞。然后用抗人CD3/28的活化微球将富集的CD4~+T细胞活化3-5天,然后与慢病毒共同离心然后孵育过夜进行转染。然后通过FCM来检测ins TCR的表达。4.预处理及致糖尿病性T细胞转输至HLA-DQ8转基因的免疫缺陷的人源化小鼠利用链脲菌素(STZ)及Ins B9-23/完全弗式佐剂(CFA)免疫的方法预处理HLA-DQ8转基因人源化小鼠,然后转输自体来源的经过基因工程改造后可表达致糖尿病TCR的人CD4~+T细胞。实验结果:1.用基因工程的方法成功制备含有ins TCR的慢病毒载体,而该慢病毒转染的细胞可以同时表达ins TCR和绿色荧光蛋白(GFP)。此外,该载体携带的ins TCR为HLA-DQ8限制性,并能够特异性识别由HLA-DQ8提呈的Ins B9-23多肽。2.成功构建具有人的免疫系统的人源化小鼠,并从供者人源化小鼠的脾脏细胞中分离出人的CD4~+T细胞。然后进行ins TCR的慢病毒转染,获得可以表达ins TCR和GFP的具有HLA-DQ8限制性的致糖尿病性T细胞。3.通过过继转移自体耐受的、经过基因工程改造后能够表达ins TCR的人T细胞,在人源化小鼠中诱导出小鼠高血糖和胰岛炎。成功建立人源化小鼠的T1D模型。结论:本项目是利用HLA-DQ8转基因NSG小鼠和HLA-DQ8阳性人胚胎标本建立了具有HLA-DQ8背景的人源化小鼠;以此为基础,通过回输自体来源的胰岛素抗原人自身反应性CD4~+T细胞,由人T细胞攻击小鼠胰岛组织导致胰岛破坏、血糖上升等Ⅰ型糖尿病症状,成功建立了Ⅰ型糖尿病人源化小鼠模型。Ⅰ型糖尿病人源化小鼠模型说明基因工程改造的人自身反应性CD4~+T细胞在人源化小鼠体内体内具有致病性,说明在人体内可能也具有致病性。Ⅰ型糖尿病人源化小鼠存在正常功能的人免疫系统,可以大大地缩小小鼠与人之间的物种差距,适合用来研究人的T1D的病理机制,是很有价值的体内研究模型。该模型最适合应用于对人体内早期T1D抗原特异性免疫反应的研究,这是迄今为止其他动物模型所不具备的优势。