银线草指纹图谱及化学成分的研究

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银线草(Chloranthus japonicus Sieb.)为金粟兰科金粟兰属多年生的草本植物,主产于中国的黑龙江、辽宁、吉林、陕西、山西和甘肃等省,以根或者全草入药,在民间是治疗跌打损伤、瘀血肿痛、风湿痛、毒蛇咬伤、疖疮肿毒的良药,具有很高的药用价值。目前有关银线草的成分分离鉴定、药理学等方面已有报道,但对质量控制方面少有研究,限制了对它们的开发与利用。本研究是在前人和本课题组研究的基础上,采用了HPLC法对产自辽宁、吉林、黑龙江和陕西省的13批次银线草指纹图谱进行探讨,建立银线草甲醇提取物的指纹图谱,以揭示其化学成分的差异,为银线草质量标准的制定提供科学依据。同时本实验通过LC-MS联用技术对其化学成分进行鉴定,并测定不同部位、不同采收季节银线草中酚酸类和香豆素类物质的含量,为银线草全株合理的利用和适时的采收提供参考。本实验的主要结果如下:(1)银线草的提取条件为:银线草粉末1g,加入70%甲醇5mL,提取2次,合并提取液,摇匀,过0.22μm微孔滤膜。最佳色谱条件为:采用Phenomenex C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱;流动相:A甲酸水,B甲醇;梯度洗脱的条件:0-5min,甲醇15%~25%;5~20min,甲醇25%~30%;20-45min,甲醇30%-40%;45~95min,甲醇40%-60%。流速0.8mL/min;检测波长323nm;柱温25℃;记录时间95min;进样量10μL。(2)构建了陕西、黑龙江、吉林和辽宁四个主产区的13批银线草的指纹图谱,以迷迭香酸为参照峰,从13批银线草的特征峰中确定了12个共有峰,对13批次的银线草指纹图谱进行相似度进计算,发现不同产地银线草的指纹图谱存在一定的差异,通过对共有峰的相对峰面积进行聚类分析,将这13批银线草样品大致分为2类。通过考察银线草指纹图谱的稳定性、重现性和精密度,得到主要峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD值均小于3%,说明建立的银线草指纹图谱方法可行、系统稳定,符合中药指纹图谱建立的要求,为银线草质量标准的建立提供了一定的参考。(3)运用液质联用技术对反丁烯二酸、异秦皮啶、绿原酸和迷迭香酸的结构进行了初步表征及含量的测定。结果表明银线草中的异秦皮啶主要存在于银线草的根中,且根中的含量高于《中国药典》(2010)版规定的金粟兰科草珊瑚属肿节风药材的异秦皮啶含量0.02%。反丁烯二酸主要存在于茎和叶中,4、5月份的含量高于6、7月份;绿原酸则主要存在于叶中,4-6月份叶里的含量远高于根和茎中,其中4月份含量最高;迷迭香酸主要存在于叶中,5-7月份叶里的含量远高于茎和根中,其中5月份含量最高,超过《中国药典》(2010)版规定的金粟兰科草珊瑚属肿节风药材中的迷迭香酸含量0.02%。
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