棉花胚珠中Loewus代谢途径基因的克隆与生化功能研究

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肌醇(myo-inositol)及其衍生物在植物体内发挥重要作用,如信号转导、基因表达调控、细胞壁多糖的合成、生长素感受、磷的储存等。肌醇的从新合成途径称为Loewus途径,是两步连续的反应,第一步是葡萄糖-6-磷酸在肌醇磷酸合酶(MIPS)的催化下生成肌醇-3-磷酸,第二步是肌醇-3-磷酸在肌醇单磷酸酶(IMP)的催化下生成肌醇。  本文从Shi等含11,692个独立EST的陆地棉cDNA微阵列杂交数据中,发现MIPS与IMP的相关探针信号在棉纤维快速伸长期均有不同程度升高,其中IMP探针信号在开花后10天(10DPA)显著升高。从棉花EST库中进行检索和拼接,克隆得到了陆地棉两个编码MIPS的基因(GhMIPS1和GhMIPS2)以及两个编码IMP的基因(GhIMP1和GhIMP2)的CDS全长。QRT-PCR结果表明,占主要转录水平的基因GhMIPS1和GhIMP1在棉花纤维快速伸长期(尤其是10DPA)有显著升高趋势,这表明肌醇合成途径在棉纤维快速伸长期在转录水平上显著高调。利用pET-28a原核表达系统,成功将GhMIPS1和GhIMP1的蛋白在体外表达并纯化,用GC-MS对这两个酶的产物进行初步检测表明,GhMIPS1和GhIMP1能够在催化葡萄糖-6-磷酸最终生成肌醇,表明这两个酶是具有活性的。利用GC-MS技术,提取并检测了棉花体内肌醇含量,其中快速伸长期10DPA纤维中的肌醇含量显著高于10DPA胚珠以及fl突变体胚珠,这和肌醇合成途径相关基因在纤维快速发育期转录水平上显著高调是相吻合的。  另外,本文还利用基因组步移PCR获得了棉纤维快速伸长期特异性高调基因GhIMP1的一段启动子区序列,并用生物信息学工具进行了初步分析,这对于研究这个基因是如何被调控转录的具有一定意义。  以上数据表明肌醇合成途径在棉花纤维快速伸长期显著高调,肌醇在棉花纤维快速伸长期也发挥重要作用,肌醇发挥作用的具体机制如何有待后续实验证明。  
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