前言众所周知,肺癌多年来一直是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,对全人类的身体健康和生命安全带来了十分严重的威胁。同时,随着全球大气环境的不断恶化、劣质食品添加剂的滥用,以及吸烟、饮酒等不良习惯的年轻化,肺癌的发病率也逐渐增加。GLOBOCAN最新数据显示,2018年全球新发肺癌病例210万例,占所有新发病例的11.6%(排恶性肿瘤第一);180万人死亡,占所有肿瘤死亡人数的18.4%(排名第一)[1]。幸运的是,近年来,随着免疫治疗和靶向治疗的飞速发展,肺癌的死亡率有所下降。然而,与欧洲国家5年肺癌生存率的20%相比,中国只能达到15%左右[2]。幸运的是,经过多项研究证实,相比于高加索人群总突变率仅仅5%左右的基因表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变,包括中国人在内的亚裔人群的EGFR基因突变率可达到20%以上。特别是没有吸烟史的女性腺癌患者甚至可以达到50-60%的突变率[3]。同时多项国际研究表明,EGFR突变阳性人群在接受EGFR-TKI治疗后,同标准化疗方案相比,在提高肺癌患者生活质量的同时,大大提升了患者总生存期(overall Survival,OS)[4-6]。所以在肺癌患者进行病理诊断之后,其分子分型也尤为重要。肺癌肿瘤组织EGFR基因突变状态对预测EGFR-TKI的功效具有重要的价值。然而,对于晚期NSCLC患者来说,其病理诊断多经过气管镜或者穿刺,其样本量通常较小,不足以检测EGFR突变状态,甚至有些患者不能取得病理组织。作为一种非侵入性检测,以循环肿瘤DNA(Cell-free tumor DNA,ct DNA)为代表的液体活检可作为检测EGFR突变的一种补充手段,其独特的优势是一定程度上克服了肿瘤的异质性[7-8]。然而,ct DNA检测仍具有一定局限性,其对EGFR突变状态检测表现出高特异性,但灵敏性较低。其原因可能是在血浆ct DNA中检测到基因突变的能力与肿瘤负荷密切相关,肿瘤负荷越小的患者,其肿瘤组织释放到血浆中ct DNA会随之减少,其假阴性率会大幅升高,另一个原因可能是衰老细胞积累的体细胞突变对ct DNA的效用施加了限制,成体干细胞中发生的良性基因突变随着细胞增殖传递给下一代。有时肿瘤驱动基因的基因突变导致携带这些突变的干细胞增殖更快,这可能被误认为肿瘤增殖[9]。同时,大量国际多中心临床研究表明EGFR-TKI患者EGFR突变NSCLC的效率仅为70%左右[4-6,10]。目前明确的原发性耐药有T790M突变,大量数据分析表明,T790M突变只占到所有EGFR突变的1%,并不能解释将近30%EGFR-TKIs无效的原因。排除假阳性原因外,这可能与其他旁路信号通路或下游信号通路激活产生原发耐药有关或,如BIM可通过扩增MAPK1直接激活下游增值相关信号通路从而产生对EGFR-TKI的获得性耐药[11-12]。然而,目前临床上缺少相应的标记物预测EGFR-TKI的疗效。因此,有必要找到一组肿瘤标志物结合血浆ct DNA检测来预测EGFR突变状态,EGFR-TKI疗效,并监测EGFR-TKI治疗疗效。过去几十年的研究中多关注编码蛋白相关基因突变与肿瘤间的关系,近年来随着研究者对长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)的不断探索,有研究证明,lnc RNA的差异表达和突变在肿瘤的发生、转移及预后中起重要作用[13-15]。在过去的十年中,人们发现Lnc RNA在人体血液中稳定表达,并且循环Lnc RNAs可作为疾病和癌症的新型分子生物标志物[16-17]。血液生物标志物具有几个显著的优点:容易以微创方式获得,可重复测量,并且可以动态比较其表达水平的变化。然而,目前尚未系统地研究循环Lnc RNA与EGFR突变状态之间的关联及其在监测EGFR-TKI治疗疗效中的应用。我们的目的是确定一组循环Lnc RNAs,以预测EGFR突变状态,联合血浆ct DNA检测可以提高其灵敏性,同时我们也希望能探索寻找到的循环Lnc RNA能够预测EGFR突变阳性患者接受EGFR-TKI疗效,并探索该Lnc RNA组监测EGFR-TKIs治疗效果的潜力。方法第一部分:初步筛选NSCLC EGFR阳性突变和野生型患者胸腔积液中Lnc RNA的差异表达目的:通过Clariom D Human芯片分析初步筛选NSCLC EGFR突变阳性与野生型患者胸腔积液中差异表达Lnc RNA。方法:收集经病理组织学和细胞诊断为NSCLC患者的胸腔积液,由ARMS法检测配对肿瘤组织及胸腔积液EGFR突变状态,筛选结果均为EGFR突变阳性与野生型各3例胸腔积液。运用Clariom D Human芯片技术对两组胸腔积液样本进行分析建立差异Lnc RNA表达谱。进一步通过GO分析及FC值筛选EGFR突变阳性与野生型胸腔积液中显著差异表达Lnc RNAs。结果:在胸腔积液样本中,EGFR突变阳性与EGFR野生型相比,筛选出差异表达Lnc RNAs 61个,有48个Lnc RNAs显著上调,有13个s Lnc RNA显著下调,其中有25个未被报道的lnc RNs A。对差异表达Lnc RNA进行GO分析表明,EGFR突变状态差异表达的Lnc RNA可以富集到1142个分子功能。其中,SCARNA7、MALAT1、NONHSAT017369、NONHSAT051892和FTH1P2与EGFR突变状态显著相关。结论:构建了胸腔积液中EGFR突变阳性和EGFR野生型差异Lnc RNA表达谱。在61个差异表达的lnc RNA中发现了25个未报告的新的lnc RNA。为肿瘤学研究和后续实验提供了有价值的数据资源。第二部分:NSCLC患者胸腔积液EGFR突变阳性与EGFR野生型差异表达Lnc RNA的分析与验证目的:q RT-PCR用于检测NSCLC患者胸腔积液中备选目的Lnc RNA的表达,并筛选可能与EGFR敏感突变相关的特异性Lnc RNA。方法:结合胸腔积液芯片结果,共网络表达分析和文献综述,筛选出5个备选目的Lnc RNA。在77例晚期NSCLS患者胸腔积液中(35例EGFR阳性突变,42例EGFR野生型,所有EGFR突变状态的患者均通过组织检测确认,并在样本中发现肿瘤细胞)通过q RT-PCR验证和分析备选目的差异Lnc RNA。结果:结合胸腔积液芯片结果、GO分析以及查阅文献显示:SCARNA7、MALAT1、NONHSAT017369、NONHSAT051892和FTH1P2与EGFR突变状态显著相关。对5个备选目的Lnc RNA进行q RT-PCR检测,结果显示NONHSAT051892和FTH1P2在NSCLC EGFR突变阳性和野生型患者胸腔积液之间没有显着差异表达。相比于EGFR野生型,SCARNA7、MALAT1和NONHSAT017369在EGFR阳性突变组中显著上调。第三部分:NSCLC患者血浆中EGFR突变阳性和EGFR野生型差异Lnc RNA表达分析和验证目的:采用q RT-PCR法检测晚期NSCLC患者血浆中目的Lnc RNA的表达水平,并确定Lnc RNA与EGFR敏感突变相关。方法:采用q RT-PCR法对经ARMS法检测肿瘤组织晚期NSCLC患者EGFR突变阳性72例和晚期NSCLC患者EGFR野生型70例配对血浆样本进行检测,检测目标为通过胸腔积液验证的目的3个Lnc RNAs。使用非配对T检验对EGFR突变阳性组和EGFR野生型组之间的3个差异Lnc RNA进行相关方差分析。同时对入组患者的临床病理特征等使用卡方检验进行分析。采用受试者工作特征曲线(Receiving Operating Characteristics Curve,ROC)对单个Lnc RNA预测EGFR突变状态进行预测并且Logistic回归分析(Logistic Regression)评估多个Lnc RNA组合预测EGFR突变状态的能力。进一步采用Kaplan-Meier生存分析对血浆Lnc RNA初始表达水平与EGFR突变阳性接受EGFR-TKI治疗患者的PFS进行分析。并且对入组患者临床病理特征及Lnc RNA初始表达水平与PFS之间进行多因素分析。结果:在血浆中与EGFR野生型相比,SCARNA7、MALAT1和NONHSAT017369表现出与胸腔积液一致的结果,均在EGFR突变阳性组中上调,ROC曲线下面积分别为0.76,0.89和0.76,敏感性和特异性分别为80.8%、79.2%,79.7%和69.1%,85.7%、63.6%。对于3个Lnc RNAs的联合诊断模型中,其AUC=0.920,PPV和NPV均超过82%。此外,EGFR突变亚型分析显示血浆MALAT1与EGFR19外显子缺失突变(mutation of exon 19 deletion,19DEL)显着相关。EGFR 19DEL NSCLC患者血浆中MALAT1显著上调。多变量分析显示,吸烟史与EGFR突变状态密切相关。MALAT1的表达水平与PFS显著相关(m PFS:11.6 VS 8.2月,p=0.020,HR:0.431;95%CI,0.236-0.787)。经过多因素分析显示MALAT1和吸烟史是接受EGFR-TKI治疗的NSCLC患者疗效的重要预测因素。结论:循环SCARNA7、MALAT1、和NONHSAT017369有望成为区分EGFR突变阳性和野生型分子分型的潜在生物标志物;MALAT1的表达水平与接受EGFR-TKI患者PFS存在显著相关性,有望作为EGFR突变阳性患者接受EGFR-TKI治疗疗效的预测标记物;吸烟史不仅与患者EGFR突变状态相关,更与接受EGFR-TKI治疗的PFS相关。第四部分:循环目的Lnc RNA与EGFR-TKI治疗疗效的动态分析目的:探讨在EGFR-TKI治疗前,治疗中和耐药进展后EGFR突变阳性NSCLC患者中循环Lnc RNA的动态变化。方法:在EGFR-TKI治疗前和治疗期间收集到36例EGFR突变阳性NSCLC患者血浆样本(其中16例在疾病进展后同时收集到其血浆样本),对上述血浆样本采用q RT-PCR方法检测SCARNA7、MALAT1和NONHSAT017369血浆动态表达水平变化,分析其EGFR-TKI治疗前,期间和进站后ΔCt值的动态变化。结果:应用EGFR-TKI治疗的36例患者中,有32例患者对其获益(PR或SD)。获益患者在治疗中有27例血浆MALAT1表达水平随治疗效果获益而降低(p=0.020),23例SCARNA7表达水平随治疗效果获益而降低(p=0.002)。同时,我们还分析了在疾病进展时采集到的16例EGFR突变阳性NSCLC患者血浆发现,进展后循环MALAT1和SCARNA7表达水平往往在疾病进展后恢复到治疗前相似水平。结论:总体而言,对3个Lnc RNA的研究表明,EGFR-TKI治疗前后循环SCARNA7和MALAT1表达水平的变化具有良好预测EGFR-TKI治疗疗效的价值。