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鸡球虫病是一种寄生在细胞内的原虫疾病,给养禽业所带来的经济损失极为严重。堆型艾美耳球虫属于中等毒力的小肠感染的球虫,其分布很广各种年龄鸡均可感染,感染后产生的免疫力弱,常引起亚临床型球虫病。受感染鸡群增重受阻和产蛋量下降。这种亚临床型球虫病不易引起人们的重视,常引起饲料报酬降低和继发感染,该球虫实际引起的损失,比一般认识要大的多,给养鸡业造成巨大的经济损失。目前,应用药物防治遇到了球虫耐药性和药物残留的问题,大大限制了养禽业发展,球虫防治需要寻求新的途径。实践证明,激发宿主细胞免疫反应来防治鸡球虫病是更有效的途径之一。DNA疫苗的一个显著优势是刺激机体产生广泛的细胞免疫反应和持久的免疫记忆,尤其是联合应用一些细胞因子,构建调节型疫苗,更有诱人的应用前景。为此我们选择堆型艾美耳球虫3-1E抗原基因分别与鸡细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-18基因,通过DNA彭耳技术串联为一体,插入到相关真核表达载体当中,分别构建了pVAX1.0-3-1E、pVAX1.0-3-1E-IFN-γ、pVAX1.0-3-1E-IL-2、pVAX1.0-3-1E-IL-17、pVAX1.0-3.1E-IL-18五种DNA疫苗,进行动物免疫保护性试验比较这些DNA疫苗的免疫保护效果。实验具体分为以下几个部分:1堆型艾美耳球虫3-1E基因的克隆、鉴定及序列分析根据已发表的E.acervulina3-1E基因序列,利用电脑软件设计一对引物,从E.acervulina孢子化卵囊中提取总RNA,然后应用RT-PCR技术扩增出E.acervulina 3-1E基因并与PMD18-T载体连接,对其进行酶切鉴定、PCR鉴定和序列分析。结果表明,扩增产物大小为528bp,与GenBank上登录的E.acervulina3-1E比较,其核苷酸序列同源性为99%。2堆型艾美耳球虫3—1E基因的原核表达及表达产物纯化将E.acervulina3-1E基因克隆至原核表达载体PET-28(a)中并转化入大肠杆菌E.ColiBL21,通过IPTG诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE电泳显示,表达的融合蛋白的分子量22kD左右,且在诱导表渤小时表达量最多。细菌经超声波裂解破碎,TritonX-100洗涤,得到的包涵体被纯化,SDS-PAGE电泳显示,PET-28(a)-3-1E表达的重组蛋白大部分存在于上清中,包涵体中含量很少。3 DNA疫苗的构建利用重组DNA技术,构建了pVAX1.0-3-1E、pVAX1.0-3-1E-IFN-γ、pVAX1.0-3-1E-IL-2、pVAX1.0-3.1E-IL-17和pVAX1.0-3.1E-IL-18疫苗,酶切鉴定正确后,将重组质粒按100ug/羽鸡分别接种14日龄雏鸡,7天后取注射部位肌肉、非注射部位肌肉,用RT-PCR和Western-blot检测保护性抗原的转录与表达情况。结果表明3-1E、IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-18基因均能在注射部位转录与表达,但在非注射部位均未检测到转转录或表达产物。4堆型艾美耳球虫DNA疫苗免疫保护性实验实验动物分为pVAX1.0-3-1E组、pVAX1.0-3-1E-IFN-γ组、pVAX1.0-3-1E-IL-2组、pVAX1.0-3-1E-IL-17组、pVAX1.0-3.1E-IL-18组、非感染非免疫组、感染非免疫组以及3-1E蛋白组。每组30只实验鸡。制备好的基因疫苗和蛋白疫苗经肌肉1日龄、21日龄两次注射雏鸡,28日龄经口接种新鲜的堆型艾美耳球虫孢子化卵囊。34日龄扑杀,分别作十二指肠病变记分、OPG值、增重、抗球虫指数(ACI)几个指标测定,确定其保护力的大小。结果表明,带有ChIFN-γ和IL-2的E.acervulina免疫调节型DNA疫苗保护效果比相对应的DNA疫苗和蛋白疫苗好。构建的E.acervulina免疫调节型DNA疫苗的保护效果以pVAX1.0-3-1E-IFN-7和pVAX1.0-3-1E-IL-2最好,其增重最大,十二指肠病变记分和OPG值最小,ACI分别为180.36,180.04;其次为pVAX1.0-3-1E-IL-18和pVAX1.0-3-1E-IL-17组,ACI分别为176.07,174.7;pVAX1.0-3-1E,3-1E蛋白保护效果一般,ACI分别为171.31,160.3。