化学型属于种内变异类型，是指同种植物由于所含化学成分的差异可分为多种类型，但它们的形态上差别不显著，是植物种内生物多样性的一种表现。药用植物普遍存在化学型现象，而不同化学型之间由于化学成分的差异，很可能是导致同种中药材质量差异的重要因素，如质量优良的“道地药材”是某个地区生产的有效成分含量较高或配比最优的中药材，是一种地域性特化的化学型。某种特定的化学型很可能是“道地药材”的“道地”之所在。因此，药用植物化学型的研究对植物药的品质评价以及资源开发有其重要的理论意义和实用价值，同时对于确保临床用药的安全、有效也有重要意义。然而，由于药用植物化学型的形成是一个与生态环境，遗传变异相关的复杂系统的自适应过程，目前大量关于化学型的研究只是揭示表面现象，而没有更深入地揭示化学型形成的机理，不能更好地指导不同化学型的生产以及应用。樟属(cinnamomum)植物是重要的经济树种，富含多种芳香油(精油)，主成分明显含量高。从樟属植物叶中提取的芳香油在香料、医药和化工合成方面都有广泛的用途，不同的精油成分具有不同的用途。然而，同一个种内具有几个不同的化学类型，这是樟属植物各个种的共性和普遍现象，也是樟属植物生物多样性的独特表现形式。不同化学型植物往往混杂地生长在同一地区，而这些化学型从形态上无法加以区分，以致精油相互混杂，在种植过程杂化，使得所需成分的含量不高，须经过复杂精馏过程的分离才能获得合格的产品，增加了成本。另外，其有性后代叶油主成分会发生明显的变异。因此，为了更好的开发和利用樟属植物精油，阐明樟属植物不同化学型形成的机理具有重要的意义。化学型作为一种表型，生物学上说其形成应是基因型与环境之间相互作用的产物。基因有产生某一特定表型的潜力，但不是决定着这一表型的必然实现，而是决定着一系列的可能性，究竟其中哪一个可能性得到实现，要看环境而定。这里的环境除了植物生长的外部环境如土壤、气候、光照、温度等宏观生态环境，还应包括微生态环境，如植物体内的内生真菌。据我们对江西吉安的实地调查发现吉安地区的樟属植物樟[Cinnamomum camphora(L)．Presl]的五种不同化学型植物生长在同一地区，因此五种不同化学型的宏观生态环境是一致的，环境的影响只可能是植物生长的微生态环境的影响(如植物内生真菌)，同时我们采用真菌的通用引物对不同化学型叶片上的内生真菌进行直接鉴定时发现樟不同化学型叶片上具有不同类型的内生真菌。内生真菌广泛分布于植物体内，其可通过自身的代谢产物或借助本身信号作用对植物体施加影响，促进植物次生代谢产物的生成与积累。基因型是指遗传方面，过去关于化学型的遗传方面主要是从叶绿体matK基因和18SrRNA基因方面以及采用RAPD方法进行研究，这些研究的都是从植物的非功能基因入手，不能直接阐明化学型形成的机理。只有从与植物次生代谢有关的功能基因入手，才能直接从遗传方面阐明化学型形成的机理。因此，本论文以樟两种不同的化学型，即龙脑樟和芳樟为研究对象，分别从可能影响龙脑樟和芳樟这两种化学型形成的植物内生真菌以及与植物次生代谢直接相关的功能基因入手，旨在为今后阐明樟五种化学型形成的机理奠定基础，同时为道地药材的研究提供一种研究思路和模式。本论文具体的研究内容和结果如下：1、龙脑樟实生苗叶油的化学成分研究分别从10株龙脑樟母树上摘取10粒成熟的种子，发芽后移栽到花盆中进行栽培，不同时期单株取样对植株叶片精油成分采用GC以及GC-MS进行分析，结果如下：(1)樟树种子种壳紧密，透水性差，发芽需要经过如下处理：先用浓硫酸处理3min，再在25℃下温浸24h，直到大多数种子的种皮出现裂口时，取出种子置于25℃培养箱中进行培养，这样才能保证大部分种子发芽；(2)栽培3个月的植株叶油成分比较简单，同时叶片精油主成分发生了变异，分化成两种不同的化学型，即黄樟素和丁香酚甲醚，龙脑的含量很少甚至没有；(3)栽培12个月的植株叶油成分比较复杂，同时叶片精油主成分发生了变异，分化成两种不同的化学型，但是与栽培3个月的不同，它们主要分化成龙脑和1.8—桉叶油两种不同的化学型。2、龙脑樟叶片内生真菌的研究采用传统的内生真菌分离鉴定方法以及分子生物学方法从龙脑樟叶片中分离内生真菌，并采用GC和GC-MS方法对分离得到的内生真菌挥发油成分进行分析，结果从龙脑樟中的老、嫩叶片中分离得到了25株内生真菌，经过成分分析发现内生真菌“吉12”挥发油中含有龙脑，同时还含有多种吲哚类的物质，这表明内生真菌可能与龙脑樟化学型形成有关。采用ITS序列对内生真菌“吉12”进行鉴定，发现内生真菌“吉12”与同Cochliobolus nisikadoi的ITS序列同源性比较高，同源性为96％，而Cochliobolus属真菌多数是植物病原真菌，这进一步表明植物内生菌可能是从病原菌演化而来的，内生菌与植物之间的相互关系可能是病原菌与宿主之间的和谐对抗状态。3、芳樟萜类合酶基因的研究根据细毛樟(Cinnamomum tenuipilum)的香叶醇合酶基因以及其他芳樟醇合酶基因的保守区域设计多条引物，将这些引物进行配对，并先以DNA为模板，对这些不同配对的引物进行筛选获得目的片段，同时还能够获得有关萜类合酶基因的内含子信息，分析不同萜类合酶基因内含子的差异，并为今后作为分子标记早期鉴别不同化学型奠定基础。用从DNA中筛选出合适的引物用于扩增cDNA获得目的片段，使得目的片段分别从cDNA和DNA水平上得到相互验证。根据获得的目的片段序列设计引物，采用RACE(cDNA快速末端扩增技术)获得其3′和5′末端，并对整个全长基因进行功能鉴定。目前本实验取得如下的结果：(1)本实验从DNA获得了两个与萜类合酶有关的基因片段，我们命名为CTSR-1(700bp)、CTSR-2(700bp)，它们的外显子与细毛樟中香叶醇合酶基因的同源性较高，分别大于85％和92％，从cDNA中也获得2个与萜类合酶有关的基因，即CTSR-3(500bp)、CTSR-4(500bp)，它们也与细毛樟中香叶醇合酶基因的同源性较高，分别为83％和82％。另外，这四个片断之间的同源性也很高，同源性为85％。(2)采用DNAMAN对CTSR-1和CTSR-2的外显子以及内含子进行同源性比较，发现它们外显子之间的同源性很高(同源性为92％)，而内含子之间的同源性比较低(同源性为59％)。另外，将CTSR-1和CTSR-2的内含子在GenBank上进行Blast没有发现其与其它萜类合酶的具有同源性。因此可以根据不同萜类合酶基因内含子的差异作为分子标记用于不同化学型的早期鉴定。(3)通过分别对CTSR-3、CTSR-4进行3′-RACE，获得了CTSR-3和CTSR-4片段的3′末端，这两个片段分别与CTSR-3、CTSR-4之间存在143bp、181bp的重叠区，并且与细毛樟中的香叶醇合酶基因有较高的同源性。同时在进行CTSR-3的3′-RACE还获得一个发生了降解的短片段以及与GGPP还原酶有关基因的3′末端，GGPP还原酶有关基因片段我们命名为CGGPPR。(4)通过对CTSR-3进行5′-RACE获得2个片段，大小分别为440bp和340bp。这两个片段都与CTSR-3之间具有71bp的重叠区。其中440bp大小的片段与CTSR-3及其3′-RACE扩增的片段拼接后能完全翻译通，并且拼接后的片段与细毛樟香叶醇合酶基因无论在氨基酸水平还是在核酸水平上都具有很高的同源性，核酸同源性大于81％，氨基酸同源性为57％，并且翻译后的氨基酸序列中包含了萜类合酶的保守区域DDXXD。因此440bp大小的片段是CTSR-3的5′端，但是它不含有起始密码子，同时从其在氨基酸水平上与细毛樟香叶醇合酶基因比对的结果可以发现其不是一个完整的5′端，而是一个发生了降解的、缺少了大约60个左右氨基酸的片段。340bp大小的片段与细毛樟香叶醇合酶基因也具有很高的同源性，同源性为85％，但是与CTSR-3及其3′-RACEJ扩增的片段拼接后不能形成可翻译的片断，因此340bp大小的片段不是CTSR-3的5′端，而应该是其它萜类合酶基因的片断，我们命名为CTSR-5。通过上述研究，我们得出了以下结论：1、栽培3个月的植株叶精油主成分主要分化成两种化学型，即黄樟油素和丁香酚甲醚，龙脑的含量很少，甚至完全没有；栽培12个月的植株也产生了化学型的分化，但是其主成分与栽培3个月的不同，主要分化成龙脑、1.8—桉叶油等。这表明龙脑樟实生苗叶片精油会发生变异，龙脑樟化学型的形成与植物的生长发育阶段有关，这为今后从植物的生理学入手揭示樟不同化学型形成提供基础。2、本实验从龙脑樟植物叶片上分离得到的内生真菌“吉12”挥发油中含有龙脑，同时还含有多种吲哚类的物质，这表明龙脑樟化学型形成可能与植物内生真菌有关，这为今后进一步研究内生真菌与樟化学型形成机理提供基础。同时采用ITS序列对内生真菌“吉12”进行鉴定，发现内生真菌“吉12”与同Cochliobolus nisikadoi的ITS序列同源性比较高，同源性为96％，因此我们推断内生真菌“吉12”可能是属于Cochliobolus。而Cochliobolus属真菌多数是植物病原真菌，因此我们的实验结果进一步表明了植物内生菌可能是从病原菌演化而来的，内生菌与植物之间的相互关系可能是病原菌与宿主之间的和谐对抗状态。3、芳樟植物中具有许多同源性比较高的萜类合酶基因，本实验从芳樟植物叶片的DNA获得了两个与萜类合酶有关的基因片段即CTSR-1、CTSR-2，从cDNA中也获得2个与萜类合酶有关的基因，即CTSR-3、CTSR-4这4个萜类合酶基因片段的同源性比较高(同源性为85％)，因此可以根据这4个萜类合酶基因保守区设计引物获得其它化学型的相关萜类合酶基因，并研究这些萜类合酶基因在不同化学型中的表达情况，从而在遗传上阐明樟不同化学型形成的机理。4．芳樟植物萜类合酶外显子的同源性比较高，而内含子的同源性比较低，如本实验获得的CTSR-1和CTSR-2基因的外显子同源性为92.21％，但是其内含子的同源性只有59.30％，因此可以考虑根据不同化学型植物中与不同主成分合成有关基因的内含子差异作为分子标记，用于不同化学型的早期鉴定，指导今后不同化学型的生产和应用。