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橡胶是我国的战略物资。因具有胶乳产量高、质量优、经济寿命长和采胶容易等特点,巴西橡胶树(Hevea basiliensis)已成为全世界天然橡胶的唯一商业来源。因此对巴西橡胶树进行深入的基因组研究具有重要意义。目前研究者们已从橡胶树中克隆出420多种重要基因或cDNA,但这些基因都是从橡胶树基因组或cDNA文库中获得,不仅工作量大而且也无法确定它们在染色体上的位置及连锁关系。利用各种分子标记构建的橡胶树连锁遗传图饱和度也不够,直接用于育种研究难度较大,若能从单染色体入手进行研究,势必会降低难度及工作量,加快研究进程。但在目前国内外有关橡胶树的研究中,有关橡胶树单染色体高通量测序方面的研究尚未见报道。本研究拟从巴西橡胶树的单染色体入手,利用课题组已所建立并完善的巴西橡胶树单染色体微分离体系进行染色体分离,使用单细胞全基因组扩增方法来代替原有的LA-PCR体外扩增方法,对染色体进行体外扩增,并进行高通量测序,旨在为橡胶树基因组研究提供新的思路与方法,为更好的开展橡胶树分子辅助育种奠定基础。具体研究结果如下:(1)以巴西橡胶树热研7-33-97(2n=36)幼叶为材料,采用酶解去壁低渗法制片。对前人所建立的适宜巴西橡胶树单染色体显微分离的染色体标本制备方法进行优化,将前低渗时间优化为40 min,酶解时间优化为7 h 20 min,后低渗时间优化为30 min。(2)采用微细玻璃针法,成功的从巴西橡胶树热研7-33-97的中期细胞中随机分离出32条染色体(部分染色体被重复分离),其中有7条来自于同一中期细胞内。(3)对单染色体体外单细胞全基因组扩增试剂盒进行了优化,将一轮指数式扩增循环数由17次优化为21次,二轮指数式扩增模板量优化至2μg,循环数由17次优化至10次。优化后所得扩增产物效果较好。(4)用单细胞全基因组扩增法(MALBAC)对从热研7-33-97品种中随机分离出的1条染色体进行了单染色体体外扩增。经Southern杂交证实其扩增产物来自于巴西橡胶树基因组,经荧光原位杂交(FISH)验证并结合核型分析确定出这1条染色体的序号为热研7-33-97的第8号染色体。证明了采用单细胞全基因组扩增法对巴西橡胶树单染色体进行体外扩增的可行性。(5)热研7-33-97第8号染色体经Illumina平台高通量测序并过滤测序结果后进行分析统计,共得到Reads为100 bp的有效序列33887084条,其中可与橡胶树基因组(RRIM600)比对上的Reads为5262483,比对率为15.53%,又经变异检测得到SNP位点112616个,InDel位点724个,SV位点20个。这些结果可为该物种的突变模式、进化历程研究及丰富基因组遗传图谱提供基础性资料。(6)本研究将热研7-33-97的8号染色体的双重过滤后的clean reads中随机选取5000条序列,又从其中随机选取500条序列与WGS数据库进行了比对,其中有30条与橡胶树的全基因组(RRIM600)序列同源性大于90%;又将上述的500条序列在线与NCBI网站上EST数据库进行比对,结果显示只有4条序列与数据库中的EST序列有高度同源性,更多有价值的信息有待进一步的挖掘。