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本文以厦门海域产白氏文昌鱼(Branchiostomabelcheri)为实验材料,通过对文昌鱼的摄食生理生态的了解,进一步采用放射性同位素109Cd和65Zn来测定文昌鱼对镉、锌累积的动力学模型各参数,以了解这两种金属在文昌鱼体内的暴露途径及生物放大潜能。同时通过7d亚慢性毒性实验研究镉、锌对文昌鱼的毒性累积效应及体内几种重要酶的影响,从体内几种重要酶活性及脂质过氧化产物水平的变化探讨镉、锌对白氏文昌鱼的毒性效应。采用2D电泳手段对不同金属暴露时间下发生显著差异变化的蛋白进行筛选和鉴定,以寻找和文昌鱼金属胁迫相关的蛋白标志物,并通过mRNA表达谱测序技术寻找调控文昌鱼耐受金属胁迫的关键基因及主要信号通路,为文昌鱼的毒理效应研究中提供理论依据。
研究结果如下:
1、了解文昌鱼的摄食行为是对其进行金属累积研究的基础。首先我们从清滤率测定、颗粒选择、有机碳吸收几方面对厦门文昌鱼的摄食生理进行了研究,结果显示厦门海域存在的两种文昌鱼均对半径较大的食物颗粒表现出高清滤率,且两种文昌鱼的摄食高峰出现在不同的时间点。文昌鱼对单胞藻及沉积物混合悬浮液的颗粒选择性的研究显示文昌鱼并没有表现出对藻类的优先选择,在低颗粒浓度环境中,文昌鱼较易滤食沉积物,而随着外界颗粒浓度上升,文昌鱼对有机质和沉积物表现出了相当的滤食能力。不同藻类对文昌鱼的有机碳同化率影响较大,硅藻饵料能使文昌鱼获得更多的有机碳。
2、采用放射性同位素示踪法测定文昌鱼对金属Cd、Zn的水相吸收速率常数ku,饵料源金属的同化率AE,金属的排除率常数ke和摄食率IR,并运用生物动力学模型,比较饵料暴露和水体暴露对文昌鱼的金属累积的相对重要性和食物链传递因子TTF。结果表明文昌鱼对Cd、Zn的吸收速率常数分别为0.107Lg-1d-1和0.061Lg-1d-1。两种金属的AE随着藻类的不同而有所差异,其中Cd的AE范围在6.2-37.7%,Zn的AE范围在8.4-42.9%。水体暴露后Cd和Zn的金属排出率ke为分别为0.012和0.031d-1,而饵料暴露后则分别为0.033和0.040d-1。将测得的参数数值代入模型发现,对Cd的吸收水相暴露成为其主要的方式,对Zn累积而言,食物相暴露比水相途径更为重要,且在自然条件下,Cd和Zn两种金属通过文昌鱼进行食物链放大的可能性很小。
3、采用亚慢性毒性实验研究了镉、锌对白氏文昌鱼的毒性累积效应及体内几种酶活性的影响,研究结果表明,镉和锌对白氏文昌鱼的96hLC50分别为4.60mg/L和2.26mg/L,相比之下锌对白氏文昌鱼的毒性更大,且文昌鱼对锌的调节能力大于镉。7d亚慢性毒性实验表明文昌鱼体内的乙酰胆碱酯酶(AChE)活性随着金属暴露时间的延长持续下降;脂质过氧化程度(MDA水平)在金属暴露初期即达到极显著水平,随后稍有下降且镉对文昌鱼体内活性氧的诱导作用大于锌;SOD活性在暴露中期受到显著抑制,之后逐渐恢复。文昌鱼体内的AKP活性在镉或锌暴露一天后被显著诱导,之后恢复至对照水平;ACP活性随镉暴露时间延长,呈现先升高再下降的趋势,而锌对ACP活性无显著影响。实验结果表明即使是很低浓度的镉、锌都会对文昌鱼的神经系统、抗氧化系统造成一定的影响。
4、在亚致死浓度镉、锌暴露胁迫下,用双向电泳(2D-PAGE)技术分离文昌鱼组织全蛋白质,并采用蛋白质组学和数据库比对技术筛选与鉴定差异蛋白质。实验结果表明,文昌鱼经低浓度镉诱导后,共产生了27个差异蛋白点,在镉暴露前后其主要差异蛋白质有始终上调的肌动蛋白,始终下调的有微管蛋白、CAVPT和CK,而随着镉暴露时间不同,小热激蛋白、肌钙蛋白、肌球蛋白及血纤维肽等蛋白的表达量也随着发生变化。而文昌鱼经低浓度锌诱导后,共产生了37个差异蛋白点,在锌暴露前后其主要差异蛋白质有始终上调的CAVPT、ATP合酶β亚基、中间丝蛋白B1、热激蛋白70、组胺受体及两种功能不明的文昌鱼未知蛋白,始终下调的有β-微管蛋白和α-烯醇酶。筛选出来的差异蛋白可能与文昌鱼组织抗金属毒性有关,部分差异蛋白质可作为镉盐或锌盐致毒机理研究的蛋白指示物。
5、通过对文昌鱼正常组织(C)、镉暴露组织(A)、锌暴露组织(B)三个样本进行高通量测序,分别获得了CvsA、CvsB和AvsB差异基因有177个、139个和99个。其中在两种金属暴露情况下均出现极显著差异表达(|log2Ratio|≥7)的基因有32个;仅出现在镉暴露处理中且差异极显著的基因有53个;而特异表达于锌处理组的显著差异基因有22个。其差异基因的GO功能显著性富集于结构分子活性、核酸结合、RNA结合。通过对参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径的差异表达基因进行Pathway显著性富集分析发现,最显著富集的Pathway途径为核糖体代谢、氧化磷酸化和蛋白酶代谢。通过比较镉、锌两种金属暴露对文昌鱼mRNA表达量差异的影响分析,可知与镉胁迫相关的靶基因多为调节性基因,如参与信号转到的信号分子如蛋白激酶、钙调素结合蛋白等,而与锌胁迫相关的靶基因则多为调控下游基因表达的转录因子,使RNA聚合酶活性被抑制,并显著影响细胞核功能,从而影响细胞的生长。