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目的1.用HBV基因组编码HBsAg的碱基序列替换WHV基因组中相应的同源序列,构建WHV-HBV嵌合病毒可复制性克隆。2.通过尾静脉高压水注射的方法,建立WHV-HBV嵌合病毒持续复制小鼠模型。了解WHV-HBV嵌合小鼠体内的免疫应答,探索持续复制的机制。3.研究HBsAg DNA疫苗在WHV-HBV嵌合病毒小鼠模型上的免疫保护效力。方法1.以本实验室构建的pBS-WHV1.3和pBS-HBV1.3为模板,利用分子克隆技术,用HBV基因组中编码S区”a”抗原决定簇、Major HBsAg, Middle HBsAg的碱基序列替换WHV基因组中对应的同源序列。构建成功的嵌合WHV-HBV质粒,通过体外转染Huh7、HepG2细胞,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测转染细胞上清中的HBsAg。2.采用高压尾静脉注射的方式将pBS-WHV1.3、 WHV-HBV-Sa、 WHV-HBV-SS、 WHV-HBV-MS克隆转染到BALB/c小鼠肝脏内,定期采集小鼠血清和肝脏标本,通过酶联免疫吸附实验、PCR、Southern Blot及免疫组织化学染色等方法监测小鼠体内病毒血症。尾静脉注射36周后,用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)和细胞内因子染色实验,检测在HBsAg和WHcAg的H-2kd CTL表位肽、HBsAg H-2kd CD4表位肽及HBsAg、WHcAg刺激下,抗原特异性CTL和CD4细胞免疫应答。3.将pcDNA3.1-HBsAg质粒采用肌肉注射联合电击免疫小鼠,完成免疫周期后2周,尾静脉高压水注射pBS-HBV1.3、WHV-HBV-Sa、WHV-HBV-SS、WHV-HBV-MS,采集系列血清检测HBsAg、HBsAb,PCR检测血清中病毒DNA,免疫组化检测核心抗原的表达。结果1.构建WHV-HBV嵌合质粒WHV-HBV-Sa、WHV-HBV-SS、 WHV-HBV-MS,测序结果显示,成功的实现了预期的基因组替换。分别转染Huh7和HepG2细胞后,转染WHV1.3和Sa的细胞上清中未能检测到HBsAg,转染SS和MS的细胞上清中均可检测到HBsAg。2.在高压尾静脉注射WHV1.3后1天,9只小鼠中有2只病毒DNA为弱阳性。注射后1018天,所有小鼠的血清病毒DNA都呈阳性,并持续到45周。肝脏中可检测到WHcAg和WHsAg, WHcAg阳性细胞数从尾注后第10天的5%逐渐下降,到98天约为2%。Sa注射小鼠中,67%小鼠的血清用HBsAg酶联免疫实验检测为阳性,并持续阳性到45周。WHVDNA在小鼠血清中持续低水平存在。肝脏中WHcAg表达与WHV1.3组相似。高压尾静脉注射SSMS的小鼠中,注射后第1天,即可检测到HBsAg。4周后陆续转为阴性值。但是,值得注意的是MS组有两只小鼠血清HBsAg持续阳性到36周。小鼠血清中病毒DNA呈低水平持续存在。在SS和MS高压尾静脉注射的小鼠肝组织中均可检测到WHcAg。在体外,通过特异性抗原和肽段刺激小鼠脾脏淋巴细胞,细胞内因子染色实验未得到阳性结果,Elispot检测仅有两只小鼠有针对HBsAg的阳性反应。3.小鼠经pcDNA3.1-HBsAg三次电击免疫后,体内产生anti-HBs。经免疫小鼠与对照小鼠,尾静脉高压水注射Sa、SS、MS、pBS-HBV1.3,经免疫的小鼠血清中的HBsAg、病毒DNA均较快被清除,对照小鼠的血清HBsAg和病毒DNA仍然持续阳性。结论1.成功构建WHV-HBV嵌合可复制性克隆WHV-HBV-Sa、WHV-HBV-SS、 WHV-HBV-MS。2.野生型和嵌合WHV基因组可以在高压尾静脉注射小鼠体内持续表达WHV和HBV蛋白。但是,复制能力低于HBV基因组。一个主要的允许WHV基因组持续的因素是缺乏针对WHV和HBV蛋白的免疫反应。3.针对HBsAg的早期免疫可以有效的阻止嵌合WHV基因组的表达和持续。本研究的创新点及意义：1.通过分子克隆技术,构建了WHV-HBV嵌合病毒可复制性克隆。2.我们的结果提示,在高压尾静脉注射小鼠模型中,除了载体和宿主遗传背景因素,病毒因素也是病毒持续的决定性因素。3.构建成功的WHV-HBV嵌合病毒,将进一步感染土拨鼠,建立WHV-HBV嵌合重组病毒感染的土拨鼠模型,使土拨鼠模型在HBV的研究中更具实际应用价值。将为揭示HBV特异性的免疫应答特征,研究HBV急、慢性感染的发病机制,筛选慢性乙肝治疗药物和各种免疫调节手段提供一个新的技术平台。