背景:　　 糖尿病是一种严重危害人类健康的慢性代谢性疾病。国际糖尿病联盟(IDF)估计,到2025年全球将有超过3亿3000万的人患糖尿病。截止2003年,中国已成为糖尿病第二大国,仅次于印度,中国成为了全球糖尿病增长最快的国家之一。最新的流行病学调查数据显示,我国20岁以上的成人糖尿病患病率达9.7％,其中男性10.6％,女性8.8％,而糖尿病前期患病率更达15.5％。据此推算,我国有9240万成年人患糖尿病,1.482亿成年人处于糖尿病前期,糖尿病已成为我国乃至全球人类共同的威胁。2002年我国糖尿病医疗费158.2亿人民币,约占卫生事业费4％,平均普通糖尿病病人3726元/年/人(占19％),有并发症病人13897元/年/人(占81％),糖尿病的早期诊断,防治糖尿病慢性并发症对减轻患者负担尤为重要。　　 糖尿病慢性并发症是导致糖尿病患者致死致残的主要原因,不仅累及心脑血管、肾脏、视网膜、神经等重要脏器和组织,肝脏也是其重要的靶器官之一。随着糖尿病病程的延长,发生肝脏病变的危险性及其病变程度也随之增加。糖尿病性肝损伤是指糖尿病引起的肝脏组织学和功能变化,是糖尿病的一种慢性并发症。糖尿病性肝损伤主要表现为非酒精性脂肪肝病变(NAFLD),迄今为止对糖尿病并发NAFLD的发病机制还了解甚少。一方面,可能胰岛素抵抗作勾原发病因参与NAFLD的发生和发展；另一方面,肝脏脂性改变以及肝细胞员伤可加剧胰岛素抵抗,进而促进代谢综合征及其相关病变的发生。　　 然而由于肝脏本身代偿功能较强,以及早期的肝脏损害常常不明显等原因,糖尿病性肝损伤常被人们忽视,当肝损害进展至后期如肝硬化时,病情往往己不可逆转。因此,必须重视糖尿病性肝损伤,并给予有效的早期干预措施,以保护糖尿病患者的肝脏功能,减少不可逆性肝损害的发生。　　 肝脏作为胰岛素作用的主要靶器官,是人体糖及脂肪代谢的重要器官。糖尿病时脂肪分解增加,游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)产生过多并在肝脏内积聚,对肝脏造成脂毒性损害。同时,过多的FFA又可通过诸如刺激糖异生等多种途径在胰岛素靶细胞内造成胰岛素抵抗,加重糖代谢紊乱。因此,控制脂质代谢紊乱、减轻肝脏胰岛素抵抗不仅是治疗糖尿病性肝损伤的有效途径,也是治疗糖尿病的新途径之一。对胰岛素抵抗和糖尿病动物模型的研究发现,肝细胞PEPCK活性及基因表达增高。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)是抑制糖原异生的关键酶,其活性改变对肝脏葡萄糖代谢紊乱具有重要影响。在脂肪肝形成过程中,肝脏从头合成脂质的相关酶,如脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)的代谢活跃。ACC是糖代谢与脂代谢的共同调控点,是二者的联系枢纽。ACC有2种亚型,ACC1和ACC2,在肝脏中均有分布。这两个亚型由不同的基因编码,具有不同组织分布和生物学效应。Takai等研究表明ACCmRNA水平的调控具有组织特异性,在肝脏中ACCmRNA的表达水平最高。有研究发现长期高脂饮食导致肝脏细胞脂肪酸从头合成ACC1基因表达增加,促进脂肪的从头合成。ACC基因表达增加进一步加剧了肝脏中TG的积累,增加了肝脏的胰岛素抵抗。Abu-Elheiga等用基因剔除的方法来研究ACC2基因缺失的小鼠。经研究发现,由于ACC2基因的缺失,小鼠体内低含量的丙二酰辅酶A导致了脂肪酸氧化速率的增加、肝脏中脂肪堆积的减少以及肝脏中糖原的减少、FFA水平降低。这些观察支持ACC在糖尿病的脂代谢中担任了重要角色。　　 固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)是调控脂肪酸、胆固醇和甘油三酯合成酶的重要转录因子,激活SREBPs和肝脏X受体(liver X receptor,LXR)基因的转录表达,可以调控脂代谢关键酶的基因转录。SREBPs根据其结构及特征分为SREBP-1和SREBP-2,SREBP-1是一类位于内质网上的膜连接蛋白,属于螺旋-环.螺旋.亮氨酸锌指(BHLH-Zip)转录因子家族,其合成产物为结合在内质网的无活性前体,约为1150个氨基酸,当细胞内脂肪水平低时,SREBP-1前体裂解,释放出活性片段,促进脂肪合成相关酶的基因表达,增加细胞内脂肪合成。目前研究清楚的证实,SREBP-1在瘦素缺乏的肥胖小鼠(Lepob/ob)的脂肪肝的发展中起关键性的作用。SREBP-1通过调节脂肪生成酶的表达水平控制肝脏中甘油三酯的积累。在胰岛素抵抗的成因中,中性脂肪的合成是由许多酶参与的,主要酶几乎都是在基因转录水平的调节下起作用,这个转录调节担当因子之一就是SREBP-1。胰岛素抵抗引起的高胰岛素血症通过上调SREBP-1表达,促使脂肪酸从头合成增加,从而使肝脏生成FFA增多。SREBP-1又分SREBP-1a,SREBP-1c,两者是从同一基因的两个不同的启始部位转录。SREBP-1c与SREBP-1a比较是一个弱的转录活性剂,并且是肝脏和脂肪组织中主要的独立形式。SREBP*1c在调节脂肪酸合成上比胆固醇合成具有更重要的作用,被认为是一个在脂肪细胞中表达的脂肪细胞分化决定因子1(ADD1)。对2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝的动物模型研究发现,肝脏SREBP-1c mRNA表达明显高于正常对照组。Kakuma等的研究发现SREBP-1c过度表达可引起FAS基因转录增加,引起脂肪酸合成增多和TG增加,在肝脏等非脂肪组织异常沉积,形成脂肪肝。Nogalska等发现,在大鼠脂肪组织中,随着瘦素水平升高,ACC表达逐渐降低,与抑制ACC上游调控因子SREBP-1c表达有关。综上所述,PEPCK、SREBPs和CCA三者与糖脂代谢的调控密切相关,而糖脂代谢紊乱又是糖尿病性肝损伤的基础,因此推测三者在糖尿病性肝损伤的发病机制中可能具有一定作用。　　 胰岛素受体后信号通路缺陷是2型糖尿病患者胰岛素抵抗的重要机制,胰岛素和胰岛素受体结合后通过胰岛素受体底物(IRS)等一系列代谢信号,最终调节糖、脂肪和蛋白质等的代谢。IRS属于细胞质中的接头蛋白(adaptor),是胰岛素敏感组织中的一组与各种胰岛素生物效应调节关系极为密切的信号蛋白,主要连接胰岛素受体和多种效应分子。目前已发现至少有9种胰岛素受体底物(IRS-1,IRS-2,IRS-3,IRS-4,Gab-1,SHc和他的3个异构体以及p62dok),前4种作为IRS蛋白家族的主要成员,和Insulin/IGF信号转导关系密切,其中以IRS-1、IRS-2的研究最多。正常情况下,IRS-1在胰岛素信号转导中起主要的作用,但当IRS-1受抑制时,IRS-2成为胰岛素受体的主要底物,但IRS-2需要更高浓度的胰岛素才能与p85结合而传导胰岛素信号。二者比较,在胰岛素代谢效应方面,促进肌肉、脂肪组织摄取利用葡萄糖,以IRS-1为主；而促进肝脏糖原合成和抑制肝葡萄糖输出,以IRS-2为主；而同时作为调节β细胞功能的重要信号分子,IRS-1主要调节胰岛素分泌过程,IRS-2则主要调节β细胞增殖、生长、存活。随着基因剔除技术的发展,发现剔除IRS-1基因的纯合子动物(IRS-1-/-)只发生胰岛素抵抗而不导致糖尿病。在剔除IRS-2基因的纯合子动物(IRS-2-/-)中,具有全部2型糖尿病特征。　　 近年来的研究显示,非特异性炎症因子干扰胰岛素信号转导通路是导致胰岛素抵抗的重要分子机制。IKK/NFκB信号转导通路包括NFκB、NFκB抑制蛋白(Inhibitor kappaB,IκB)和IκB激酶(IκB Kinase,IKK)。NFκB广泛存在于体内细胞,是一种重要的前炎症基因的核转录因子,参与炎症反应、免疫反应、细胞凋亡及物质代谢等多种生物进程,是炎症启动、调节的关键因子,在肝组织的炎性反应、氧化应激、肝细胞凋亡和再生中发挥着重要作用。IKK(InhibitorkappaB Kinase)是调节炎症过程的关键调节因子NFκB的激活物,是炎症IKK/NFκB信号通路干扰胰岛素信号转导的枢纽。NFκB与其抑制物IκB在细胞浆中分离,进而转位至细胞核内,一方面进一步促进炎症因子的分泌和表达,另一方面可以干扰胰岛素信号转导途径,引起胰岛素抵抗。因此,本课题以糖脂代谢调控的关键靶点、胰岛素受体后信号通路及炎症信号通路为切入点,旨在探讨糖尿病性肝损害的分子机制。　　 六味地黄方为滋阴补肾的经典名方,对机体具有广泛作用,不但具有调节糖代谢和免疫功能、对抗多种损伤、稳定细胞膜等作用,而且具有价格低廉且毒副作用小的优点。近年大量研究发现,六味地黄丸可通过保护胰岛功能及改善胰岛素抵抗而减低2型糖尿病的发生率。但目前关于六味地黄丸对糖尿病性肝损伤的作用及其机制研究尚未见报道。　　 本研究以自发性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠及其同系正常鼠LETO鼠为研究对象,通过给予祖国传统中药六味地黄丸进行干预,检测模型中脂代谢相关指标及肝脏形态学改变,初步探讨六味地黄丸对肝脏的保护作用；然后对肝脏中糖脂代谢关键因子以及胰岛素受体后信号通路/炎症信号通路进行研究,尝试从分子水平阐明六味地黄丸对糖尿病性肝损伤可能的保护机制,为临床糖尿病性肝损伤的防治提供实验依据。　　 第一部分六味地黄丸对OLETF鼠肝脏脂代谢的影响　　 目的：　　 了解六味地黄丸对自发性2型糖尿病大鼠模型OLETF鼠的糖脂代谢紊乱及肝脏形态学的影响。　　 方法：　　 1、OLETF鼠随机分为2组,分别为蒸馏水对照组和六味地黄丸预防组,每组各20只。同系非糖尿病LETO鼠为正常对照组。　　 2、分别于13、18、23、30、34和40周龄以剪尾法采血测定血糖值,行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。　　 3、分别于8、32和40周龄随机处死大鼠,采集血标本；取脂肪组织；分离大鼠肝脏组织,置于液氮中保存备用。　　 4、计算内脏脂肪重量,并比较各组体脂比。　　 5、检测空腹血清葡萄糖、血浆胰岛素水平、甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸。　　 6、大鼠肝脏组织制备石蜡切片及冰冻切片,HE染色和MASSON染色观察大鼠肝脏组织学形态的改变,明确肝脏病变性质。　　 结果：　　 1、对照组和干预组负荷后2h血糖(2hPG)分别于23和30周龄时出现明显升高,分别为10.1±1.8mmol/L和9.4±2.3mmol/L。在40周龄时,对照组和干预组的葡萄糖曲线下面积(AUC)均显著高于LETO组(P<0.05),但干预组显著低于对照组(P<0.01)。　　 2、对照组和干预组分别在23和40周龄始发生糖尿病,发病率随周龄延长而升高,40周龄时发病率分别为92.9％和28.6％(P<0.01)；LETO组无糖尿病或糖耐量减低(IGT)的发生。　　 3、与LETO组相比,对照组除空腹血糖升高不显著外,大鼠体重、脂肪含量、体脂比、空腹血浆胰岛素、血清甘油三酯、胆固醇、游离脂肪酸均显著升高,胰岛素敏感指数显著降低。干预组与对照组相比,空腹血糖无明显变化,但空腹胰岛素和血清甘油三酯、胆固醇、血清游离脂肪酸均显著降低(P<0.05),胰岛素敏感指数显著增高。　　 4、8周龄时,各组大鼠肝脏结构无明显差别。32周龄时,对照组及干预组大鼠肝细胞均出现明显空泡样变性,40周龄时,对照组肝细胞空泡样变性更加明显,可见肝索排列紊乱；干预组的肝脏病变较32周龄时改善,仍见小部分肝细胞空泡样变性,肝小叶结构基本存在,有轻度肝细胞脂肪变性。MASSON染色提示40周龄对照组大鼠肝脏胶原纤维增生不明显,LETO组及干预组肝脏均未见胶原增生。　　 结论：　　 1、六味地黄丸可显著降低OLETF鼠2型糖尿病的发病率,有效预防糖尿病的发生。并能够显著降低OLETF鼠血糖升高程度,延缓高血糖的出现。　　 2、六味地黄丸能有效减少OLETF鼠内脏脂肪堆积,并显著降低血清甘油三酯、胆固醇、血清游离脂肪酸和血浆胰岛素水平。　　 3、六味地黄丸有助于改善肝细胞脂肪变性,维持OLETF鼠肝脏的正常结构。　　 第二部分六味地黄丸对OLETF鼠肝脏保护作用的机制　　 目的：　　 了解自发性2型糖尿病模型OLETF鼠糖脂代谢调控相关基因(PEPCK、SREBP-1、ACC)、炎症因子(NFκB、IKK)和胰岛素受体底物(IRS-1、IRS-2)在肝脏的表达变化及其相关性,探讨六味地黄丸干预对OLETF鼠肝脏保护作用的相关机制。　　 方法：　　 1、荧光定量RT-PCR检测PEPCK、SREBP-1、ACC在各组大鼠肝脏组织中的表达情况,并用图像分析系统分析结果。　　 2、免疫印迹法(western blot)检测p-IRS-1、p-IRS-2和IKK在各组大鼠肝脏组织中的蛋白表达情况,并用图像分析系统分析结果。　　 3、免疫组化法检测NFκB在各组大鼠肝脏的表达情况,用图像分析系统分析结果。　　 4、分析IKK、NFκB、p-IRS-1、p-IRS-2、PEPCK、SREBP-1、ACC基因表达的相关性。　　 5、实验数据计量资料以均数±标准差((x)±s)。采用SPSS13.0软件进行统计。同一样本不同周龄组间均数的比较采用配伍组设计的方差分析(ANOVA)检验,LSD法进行两两比较。各指标间的相关分析采用pearson相关分析。均以α=0.05为标准。　　 结果：　　 1、六味地黄丸对各组大鼠肝脏中PEPCKmRNA表达的影响:各周龄LETO组的PEPCK表达均显著低于同周龄的对照组及干预组。40周龄时干预组大鼠PEPCK表达显著低于对照组。　　 2、六味地黄丸对各组大鼠肝脏中SREBP-1mRNA表达的影响:LETO组随周龄增加SREBP表达稳定,而对照组和干预组均随周龄而增加(P<0.01)。同周龄LETO组SREBP表达显著低于对照组和干预组(P<0.01),并且干预组显著低于对照组(p<0.01)。　　 3、六味地黄丸对各组大鼠肝脏中ACCmRNA表达的影响:各周龄对照组ACC表达均显著高于LETO组及干预组,且对照组ACC表达随周龄增加而明显增加(P<0.01)。　　 4、六味地黄丸对各组大鼠肝脏中p-IRS-1和p-IRS-2蛋白表达的影响:各组p-IRS-1和p-IRS-2表达随大鼠周龄增加呈下降趋势。对照组p—IRS-1和p-IRS-2表达在各周龄段均显著低LETO组(P<0.05)及干预组(P<0.05)。　　 5、六味地黄丸对各组大鼠肝脏中NFκB表达的影响:各组NFκB表达均随周龄而增加,其中对照组增加幅度最大。各周龄对照组NFκB表达均显著高于LETO组(P<0.01)和干预组(P<0.05)。　　 6、六味地黄丸对各组大鼠肝脏中IKK蛋白表达的影响:LETO组IKK表达随周龄增加无明显变化；对照组及干预组IKK表达均随周龄而增加,且各周龄间存在显著差异(P<0.01)。各周龄LETO组IKK表达均显著低于对照组和干预组(P<0.01),而其中干预组又显著低于对照组(P<0.01)。　　 7、IKK、NFκB分别与PEPCK(rIKK=0.701,P<0.01；rNFκB=0.756,P<0.01)、SREBP—1(rIKK=0.925,P<0.01；rNFκB=-0.870,P<0.01)、ACC(rIKK=-0.850,P<0.01；rNFκB=-0.832,P<0.01)的表达呈高度正相关；与p—IRS-1(rIKK=-0.703,P<0.01；rNFκB=-0.750,P<0.01)、p-IRS-2(rIKK=-0.505,P<0.01；rNFκB=-0.561,P<0.01)呈负相关。　　 结论：　　 1、六味地黄丸能降低OLETF鼠肝脏中PEPCKmRNA、SREBPmRNA和ACCmRNA的表达,可能通过抑制糖异生、减少脂质合成,从而改善肝脏的糖脂代谢紊乱。　　 2、六味地黄丸可能通过提高肝脏IRS-1和IRS-2表达改善胰岛素抵抗。　　 3、六味地黄丸能降低OLETF鼠IKK、NFκ表达,可能通过抑制IKK/NFκB信号通路激活,减轻炎症反应对肝脏的损害。　　 4、OLETF鼠肝脏中IKK、NFκB分别与PEPCK、SREBP-1、ACC的表达呈高度正相关(P<0.01)；与p-IRS-1、p-IRS-2呈负相关。提示肝脏的糖脂代谢紊乱和炎症与胰岛素抵抗密切相关,六味地黄丸可能通过调节糖脂代谢、减轻炎症以及改善胰岛素抵抗发挥对2型糖尿病的肝脏保护作用。