论文部分内容阅读
第一部分:ADH1B在肝癌及相应癌旁组织中的表达分析目的:本部分研究主要探索ADH1B基因在肝细胞肝癌（HCC）及癌旁组织中的表达差异,为深入了解ADH1B基因的功能和机制夯实基础,为进一步了解ADH1B基因对肝细胞肝癌（HCC）的发病机制及基因治疗研究提供理论基础。方法:对临床手术收集的HBV相关HCC 10对癌旁组织和癌组织以及5例正常肝组织标本进行RT-qPCR及Western Blot验证,分析ADH1B基因在肝癌及相匹配的癌旁临床标本中的表达差异。结果:从蛋白和基因mRNA水平观察ADH1B基因在肝癌组织中的表达显著低于癌旁组织,且差异有统计学意义（P<0.01）。结论:初步验证ADH1B基因在HBV相关HCC肝癌及癌旁组织中表达存在差异。为下一步该基因在肝癌细胞株的生物学行为影响奠定坚实基础。第二部分:过表达ADH1B基因重组慢病毒载体的构建目的:目前重组慢病毒载体（LVs）作为基因治疗载体用于获得性和遗传性疾病的应用显著增加,已成为体内或体外基因转移到分裂和非分裂细胞的有效和通用载体。本研究的目的在于构建过表达ADH1B基因慢病毒表达载体,为构建过ADH1B基因过表达稳定细胞株提供包装工具。方法:依据Genbank寻找的ADH1B基因序列设计引物,PCR扩增ADH1B基因片段,与GV-492载体经过BamHI/AgeI同时酶切后,将含有puromycin抗性的GV492-ADH1B载体质粒与慢病毒辅助质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染293T细胞收集慢病毒上清,测定慢病毒滴度。获得携带GFP和ADH1B基因的过表达重组慢病毒。结果:测序结果显示,通过普通PCR扩增、酶切鉴定、慢病毒质量监测及基因测序成功构建ADH1B过表达慢病毒载体,检测病毒滴度为2E+9TU/mL。结论:成功构建过表达LV-ADH1B基因的重组慢病毒表达载体,为下一步建立稳定肝癌细胞株及探讨该基因在肝癌中的生物学功能和分子机制提供良好工具。第三部分ADH1B基因对人肝癌细胞株生物学功能的影响目的:本部分研究主要探索构建并包装过表达ADH1B基因重组慢病毒的稳定肝癌细胞株,利用该稳定细胞株观察其对肝细胞肝癌（HCC）生物学功能的影响,进而寻找潜在的有意义的HCC诊断标志物及药物治疗靶点,为进一步明确ADH1B基因相关信号通路提供线索和方向。方法:1.对正常肝细胞LO2、肝癌细胞系HepG2以及HepG2.2.15进行RT-qPCR及Western Blot验证,分析ADH1B基因在正常肝细胞及肝癌细胞中的表达差异;2.构建并鉴定过表达ADH1B基因的稳定肝癌细胞株,用肝癌细胞作空白对照（BC）,用GV-492空载体慢病毒液转染肝癌细胞作为阴性对照（NC）,用LV-ADH1B转染肝癌细胞作为过表达组（OE）。再次采用RT-qPCR及Western Blot验证肝癌细胞株中ADH1B mRNA和蛋白表达差异以验证过表达肝癌细胞株中ADH1B过表达效果;3.利用CCK-8、细胞划痕实验、平板克隆形成实验、Transwell细胞迁移与侵袭等实验方法检测过表达ADH1B基因后HepG2细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化差异。4.常规培养过表达ADH1B基因的稳定细胞株空白组（BC）、阴性对照（NC）、过表达组（OE）组HepG2以及HepG2.2.15细胞,24h后收集各组细胞并加Trizol裂解液裂解各组细胞,置于1.5mlEP管内保存,置于带有干冰的泡沫盒送至上海欧易公司进行基因芯片检测和分析。结果:1.从蛋白和基因mRNA水平观察ADH 1B蛋白、mRNA在肝癌细胞HepG2、HepG2.2.15中的表达显著低于正常肝细胞LO2差异有统计学意义（P<0.01）;2.再次采用Western Blot和RT-qPCR技术对转染重组慢病毒LV-ADH1B后HepG2、HepG2.2.15细胞株中提取的ADH1B蛋白和mRNA进行比对,结果显示:过表达ADH1B基因的HepG2及HepG2.2.15细胞株中ADH1B蛋白及mRNA的表达均明显增高,差异有统计学意义（P<0.05）证明转染LV-ADH1B以及GV-492空载体慢病毒的肝癌细胞株HepG2及HepG2.2.15构建成功;3.细胞功能实验:CCK-8法检测细胞增殖结果显示:与HepG2空白组（BC）、HepG2阴性对照组（NC）相比,过表达ADH1B基因的HepG2细胞组（OE）细胞活力降低,差异有统计学意义（P<0.05）;划痕实验结果显示:细胞培养24h、48h后过表达ADH1B基因稳定细胞株HepG2（OE）划痕面积显著高于空白组（BC）、阴性对照组（NC）,差异有统计学意义（P<0.01）;平板克隆形成实验结果显示:与空白组（BC）、阴性对照组（NC）相比,过表达ADH1B基因组（OE）HepG2细胞克隆团数目明显降低,差异有统计学意义（P<0.01）;Transwell细胞迁移和侵袭实验结果显示:与空白组（BC）、阴性对照组（NC）相比,穿透小室过表达ADH1B基因组（OE）HepG2细胞数目明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。4.ADH1B基因过表达HepG2、HepG2.2.15细胞芯片测序结果显示:过表达ADH1B基因的HepG2与对照组相比,KEGG富集的Pathway差异表现在NF-κB、Alcoholism、MAPK、TNFβ等;过表达ADH1B基因的HepG2.2.15与对照组相比,KEGG富集的Pathway差异表现在ECM受体、Ca2+、Jak-STAT等。结论:1.初步验证ADH1B基因在正常肝细胞及肝癌细胞株HepG2及HepG2.2.15中的差异与第一部分肝癌组织实验结果相符合;2.成功构建过表达ADH1B基因的肝癌细胞系HepG2及HepG2.2.15;3.预测ADH1B基因可能通过抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭能力抑制肝细胞肝癌（HCC）转移。4.转染LV-ADH1B的肝癌细胞株HepG2、HepG2.2.15在上皮间质转换、酒精代谢、细胞凋亡等信号通路上基因表达量发生变化。