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目的：制备葛根素单克隆抗体,并研究其应用范围及方法。1合成葛根素-牛血清白蛋白(免疫原)与葛根素-多聚赖氨酸(包被原)偶联物,并制备葛根素单克隆抗体。2利用葛根素单克隆抗体建立葛根素酶联免疫吸附法,考察准确性、重复性、重现性及加样回收率,并进行药品及生物样品中葛根素含量的测定。3制备葛根素免疫亲和层析柱,优化敲除、洗脱工艺参数,考察凝胶抗体偶联比、柱容量、回收率,建立敲除样品指纹图谱。4利用免疫亲和层析柱敲除葛根素,运用对比研究方法进行葛根素在葛根抗炎效果中的作用评价5进行葛根素单克隆抗体荧光标记,利用人脐静脉内皮细胞初步探索葛根素在细胞上的作用靶点。方法：脾细胞融合制备葛根素单克隆抗体,免疫亲和层析柱进行葛根素敲除并研究葛根素药效,荧光标记法进行葛根素在细胞上的作用靶点发现。1高碘酸钠氧化法合成葛根素与载体蛋白的偶联物作为包被原(葛根素-多聚赖氨酸)及免疫原(葛根素-牛血清白蛋白),免疫后进行血清抗体检测,经过脾细胞融合,阳性杂交瘤细胞筛选,单克隆化后,腹水诱导法大量制备腹水,辛酸硫酸铵法及蛋白G柱法纯化葛根素单克隆抗体,并计算交叉反应率进行抗体特异性检测。2优化包被原包被浓度、一抗工作浓度、线性检测范围常规间接竞争ELISA法建立葛根素相关的酶联免疫吸附法。并考察其准确性、重复性、重现性及加样回收率,进行药品及生物样品中葛根素含量的测定,与常规HPLC法检测结果比较,流动相为甲醇40%：水60%,并进行相关性分析。3利用葛根素单克隆抗体,经琼脂糖凝胶活化、抗体偶联、封闭、洗杂、平衡后,装柱并制备葛根素免疫亲和层析柱。优化筛选上样缓冲液、敲除缓冲液和洗脱缓冲液以及流速条件,通过考察抗体凝胶偶联比、柱容量、回收率评价已制备的葛根素免疫亲和层析柱。建立敲除样品的指纹图谱,条件为：安捷伦1260,安捷伦ZORBAX SBC-18柱,进样量10-μL,流速1mL/min,柱温25℃流动相为甲醇水溶液,梯度浓度为0-10min甲醇由0-23%,10-30min甲醇浓度保持23%,30-50min甲醇由23-35%,50-60min甲醇由35-70%。4通过葛根素免疫亲和层析柱敲除葛根提取液中的葛根素,以LPS诱导巨噬细胞分泌IL-1β及NO,通过葛根素敲除前后药效对比研究,观察葛根素在葛根对白介素1β及一氧化氮的抑制效果中的作用。5利用荧光蛋白标记法进行葛根素单克隆抗体的荧光标记,人脐静脉内皮细胞经10%小鼠血清封闭1小时后,葛根素1μ g/mL培养1小时,加入荧光标记抗体(1：100稀释)孵育半小时后经荧光倒置显微镜观察荧光标记情况。结果：经过性能检测,葛根素单克隆抗体制备成功,所建立的葛根素酶联免疫吸附法及免疫亲和层析柱性能稳定,精密度高,回收率好,重复性均符合要求,制备成功,可用于葛根素的药理药效研究,荧光标记成功,初步判断葛根素在人脐静脉内皮细胞中的作用靶点位于细胞核膜上。1葛根素人工抗原合成成功,经紫外检测并计算得出其偶联比为6：1,经融合筛选后成功制备出分泌抗葛根素单克隆抗体的细胞株AA9,所分泌抗体特异性强,除与黄芩素有51.8%的交叉反应外,与其余结构类似物均无明显交叉反应(交叉反应率均<0.01)。2利用葛根素单克隆抗体成功建立了酶联免疫吸附法,包被原浓度为1μ g/mL,抗体工作浓度为10ng/mL,线性竞争范围为10ng-1.28μ g,灵敏度(50%抑制时的浓度)为128ng/mL,线性方程为：y=-0.156ln(x)+1.2804,R2=0.997。准确性及重复性良好,孔间差变异系数<3%,板间差变异系数<7.5%,平均加样回收率为101.4%,可以用于样品检测。3制备了葛根素免疫亲和层析柱,并对上样敲除洗脱条件进行了优化,上样及敲除缓冲液均选为蒸馏水,洗脱缓冲液选为30%甲醇,抗体偶联率为98%,抗体凝胶偶联比为13.5mg/mL,柱容量为13.6μ g/mL.并制备了样品及敲除提取液的HPLC指纹图谱,成功建立了葛根素敲除法。4利用敲除法评价葛根素在葛根抗炎效果中的作用。将处于对数生长期的巨噬细胞分为空白对照组(C)、模型对照组(M)、给药组：葛根提取液组(PLRE)、葛根素敲除组(PU-KO-PLRE)和葛根素组(PU)。培养的巨噬细胞经LPS诱导后NO及IL-1β分泌明显增加,而葛根素明显抑制IL-1β分泌,敲除后则明显不能抑制,说明葛根对LPS诱导的IL-1β分泌抑制作用主要为葛根素产生。5葛根素单克隆抗体经过蛋白G纯化后,用荧光蛋白进行标记。人脐静脉内皮细胞培养至对数生长期后分为空白对照组(C)、葛根素对照组(PU)、抗体对照组(MAb)、葛根素加标记抗体组(P+M),按组别分别给予标记抗体或葛根素后充分孵育,荧光倒置显微镜观察到,空白对照组、葛根素对照组、标记抗体组均无特征性荧光产生,而葛根素加标记抗体组可观察到细胞核膜上有明显荧光产生。讨论：高碘酸钠法合成葛根素效果良好,葛根素单抗灵敏度高,能用于葛根素的微量分析,比常规的HPLC方法更加快速准确,前处理方法更加简化。免疫亲和层析柱可用于中药提取液或复方中的物质敲除,借助敲除前后的比较研究可证明活性物质在药材或复方中的真正药理作用与贡献度。