研究背景与目的子宫内膜癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,且随着经济社会发展,发病率在全世界范围内呈上升趋势。与其他腺癌的发展一样,子宫内膜癌的发展经过一系列复杂变化,包括从不典型增生到高分化癌。在临床上,年龄、肥胖、不孕、长期高雌激素水平等都可能成为子宫内膜癌发生的危险因素,而长期暴露于高雌激素水平被认为是最危险的因素。子宫内膜癌的分类方法很多种,目前根据临床症状及病理类型把子宫内膜癌分为两种类型,即Ⅰ型和Ⅱ型。第一种类型,Ⅰ型子宫内膜癌即雌激素依赖型子宫内膜癌,常发生于围绝经期妇女,尤其是子宫内膜长期处于高雌激素水平刺激而无孕激素抵抗的妇女,在白人妇女尤为常见。这种类型的子宫内膜癌病理类型类似正常子宫内膜。Ⅱ型子宫内膜癌,即非雌激素依赖型,发病与雌激素无明显关系。此类型常发生于老年、绝经后的妇女,常见于非裔美国人。这类子宫内膜癌的病理形态属少见类型,如子宫内膜浆液性乳头癌、透明细胞癌等,且肿瘤分化差,恶性程度高,常侵润到子宫肌层深部,预后不良。子宫内膜癌的发生、发展是多种因素参与、多步骤的复杂过程,多数学者认为是下列因素相互作用的结果：激素的调节,基因突变,粘附分子,细胞凋亡等。若子宫内膜癌患者在早期诊断并经正规治疗,5年生存率为80%。但不是所有患者能在早期阶段发现,因此,转移是子宫内膜癌患者死亡的主要原因。然而,子宫内膜癌发生发展的分子机制尚不明确。肝癌衍生生长因子(Hepatoma-derived growth factor,HDGF)是一种肝素结合的生长因子,最初从人肝癌HuH-7细胞系无血清培养的上清液中分离得到。HDGF在胚胎组织表达最高,且与多器官如心血管系统、肝脏及肾脏等器官发育密切相关。HDGF在血管增生、内皮细胞增殖、迁移等细胞活动中发挥着重要作用。最开始认为HDGF定位于包浆,但后来证实是一个含有典型的双向核定位序列的核定位蛋白,它通过核定位序列转移到细胞核内而发挥维持细胞活性的功能。最近有研究发现,有在几种小鼠和人的癌中HDGF的表达高于癌旁组织。还有研究发现,HDGF表达与肿瘤的恶性生长有关,如增殖、侵袭及转移。因此,HDGF可能是一个与肿瘤预后相关的因子。磷脂酰肌醇3一激酶(PI3Ks),因具有通过磷酸化肌醇环的3’-OH基团的肌醇磷脂,以产生第二信使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯的能力(PI-3,4,5-P(3))而构成脂质激酶家族。包浆膜上的PI3K通过激活RPTK产生PI(3,4,5)P(3)和PI(3,4)P(2),这些脂质与AKT结合后转移到包膜内侧,磷酸化后并被PDKl和PDK2激活。活化的Akt调节涉及细胞存活,细胞周期和细胞生长的调节等众多功能。近年来国内外研究发现,很多肿瘤的发生发展与PI3K/AKT信号通路的异常激活相关。PI3K和Akt活性的异常增高与肿瘤细胞的血管形成、侵袭转移、抗凋亡、异常增殖等生物学行为密切相关。目前,尚无有关HDGF与子宫内膜癌的文献报道。本课题的研究目的为明确HDGF基因在子宫内膜癌中的功能,探讨其与临床参数的关系及参与的信号转导通路,为子宫内膜癌发生发展的分子机制研究提供新思路。研究内容与方法1.HDGF基因在子宫内膜癌组织中表达及与临床参数之间的关系(1)本研究所采用的122例子宫内膜癌、20例正常子宫内膜及22例不典型增生内膜组织切片均来自于广州医科大学(原广州医学院)第三附属医院2002-2008年间住院患者。子宫内膜癌患者在手术前均未接受化疗或放疗。患者平均年龄51.3岁(30-82岁)。临床随访时间是5至96月。所有标本均经病理检查确诊,术后根据FIGO2009对患者进行手术-病理分期。(2)采用SP免疫组织化学方法检测122例子宫内膜癌、22例子宫内膜不典型增生、20例正常子宫内膜组织的HDGF表达情况,并分析HDGF的表达与临床参数之间的关系。(3)由两位病理专家对所有免疫组化染色的切片进行双盲分析。HDGF蛋白表达定位于胞核,按阳性细胞个数占比例计算,其中根据阳性细胞个数比例≥80%为高表达,<80%为低表达。2.HDGF基因在子宫内膜癌中功能初步研究(1)构建靶向HDGF的shRNA慢病毒干扰载体,包装成成熟颗粒,感染高成瘤细胞,建立稳定干扰HDGF的子宫内膜癌细胞株,以空载作为对照。(2)以空载作为对照,利用MTT法检测干扰HDGF的子宫内膜癌细胞的增殖能力。(3)以空载作为对照,利用平板克隆法检测干扰HDGF的子宫内膜癌细胞的生长能力。(4)以空载作为对照,Transwell小室迁移实验检测干扰HDGF的子宫内膜癌细胞的迁移能力。(5)以空载作为对照,Boyden小室侵袭实验检测干扰HDGF的子宫内膜癌细胞的侵袭能力。(6)检测稳定干扰HDGF的子宫内膜癌细胞裸鼠皮下成瘤能力的改变。3.HDGF基因介导的分子基础初步研究(1)利用western blot检测干扰HDGF后PI3K/Akt信号通路相关基因PI3K、pPBK、pAkt、Akt的变化。(2)Western blot检测细胞周期相关基因CDK4、CCND1、P15、P21及EMT标志物N-cadherin、Vimentin的表达。4.统计分析所有数据均用SPSS17.0统计软件处理,当P<0.05时认为差异具有统计学意义。结果1.HDGF基因在子宫内膜癌组织中表达及与临床参数之间的关系(1)应用免疫组织化学染色法检测122例子宫内膜癌石蜡切片,22例不典型增生内膜及20例正常子宫内膜石蜡切片的HDGF蛋白在细胞中的表达位置及过表达率。HDGF在EC组织及非肿瘤组织中均表达于胞核,在子宫内膜癌,不典型增生内膜及正常子宫内膜的高表达率分别为25.5%(31/122),13.6%(3/122),5%(1/20),差别有显著性(χ2=115.03,P<0.001),子宫内膜癌组织中HDGF的表达显著高于非肿瘤组织。(2)分析HDGF表达水平与子宫内膜癌患者临床病理参数的关系。HDGF高表达在年龄、月经状态、组织分型、淋巴转移以及肌层浸润的深度中无统计学意义,在FIGO分期差异有显著意义(P=0.032)。(3)我们用Kaplan-Meier法及log-rank检验进行生存率的估计与生存曲线的分析,在122例子宫内膜癌患者组织中,发现HDGF的阳性表达与患者生存率呈负相关(P=0.001)。多因素分析显示,HDGF不是EC患者预后的独立影响因素(P=0.111)。2.HDGF基因在子宫内膜癌细胞功能的初步研究(1)抑制HDGF表达对子宫内膜癌细胞生物学特性的影响。构建靶向HDGF的ShRNA1慢病毒干扰载体,稳定干扰子宫内膜癌细胞HEC-1B和Ishikawa,由于感染效率达到90%以上,western blot检测干扰后HDGF蛋白的表达明显下降,可直接用于后续实验。阳性干扰多克隆命名为HEC-1B shHDGF、Ishikawa shHDGF,阴性对照多克隆为HEC-1B PLV-Ctr、Ishikawa PLV-Ctr.(2)MTT法检测细胞增殖情况,与空载对照细胞HEC-1B PLV-Ctr、Ishikawa PLV-Ctr相比,干扰细胞HEC-1B shHDGF、Ishikawa shHDGF生长速度明显减慢,差异有统计学意义(HEC-1B细胞株F=259.5, P<0.001;Ishikawa细胞株F=38.324,P<0.001)(3)平板克隆法检测细胞生长情况,与空载对照细胞HEC-1B PLV-Ctr、Ishikawa PLV-Ctr相比,干扰细胞HEC-1B shHDGF、Ishikawa shHDGF生长速度明显减慢,差异有统计学意义(HEC-1B细胞株t=3.74, P=0.02;Ishikawa细胞株t=4.9,P=0.008)。(4)Transwell小室迁移实验,细胞培养12h后HEC-1B shHDGF、Ishikawa shHDGF穿过聚碳酸酯膜的数量少于HEC-1B PLV-Ctr、Ishikawa PLV-Ctr (HEC-IB细胞株t=7.17,P=0.002;Ishikawa细胞株t=7.89,P<0.001)。提示干扰HDGF后,细胞迁移能力减弱。(5)Boyden小室侵袭实验,与空载细胞相比,HEC-1B shHDGF、Ishikawa shHDGF穿过聚碳酸酯膜的数量明显减少,差异具有统计学意义(HEC-1B细胞株t=9.04,P<0.001;Ishikawa细胞株t=8.48,P<0.001),提示干扰HDGF后,细胞侵袭能力减弱。(6)裸鼠皮下成瘤,与空载对照组细胞相比,HEC-1B shHDGF、Ishikawa shHDGF两处理组细胞的裸鼠成瘤速度显著减慢,差异有统计学意义(HEC-1BF=255.9,P<0.001;Ishikawa F=216.5,P<0.001)。3. HDGF在子宫内膜癌中介导的分子机制研究(1)采用western blot检测了干扰HDGF后PI3K/Akt信号通路相关基因P13K、pPI3K、pAkt、Akt的表达。结果显示,与空载对照组细胞相比,HEC-1B shHDGF、 Ishikawa shHDGF组的PI3K、Akt无明显变化,pPI3K、pAkt表达下调。(2)干扰HDGF后细胞周期相关基因及EMT标志物的表达变化。结果显示,与空载对照组细胞相比,HEC-1B shHDGF、Ishikawa shHDGF组的P15、P21在干扰细胞中表达上调,CCND1、CDK4表达下降。EMT相关N-cadherin、 Vimentin表达下调。结论1.HDGF蛋白在子宫内膜癌的核高表达率明显高于子宫内膜不典型增生及正常子宫内膜组织,且HDGF的核高表达率与子宫内膜癌病人的FIGO分期正相关,与病人的生存时间负相关。因此,HDGF很可能是一个子宫内膜癌预后不良的影响因素。2.干扰HDGF后,子宫内膜癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力显著减弱,进一步提示HDGF在子宫内膜癌中发挥了癌基因的功能。3. HDGF基因通过介导PI3K/AKT信号通路影响子宫内膜癌的发生发展。