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背景疼痛是一种与组织损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验,常常伴随有强烈的负性情绪,焦虑、抑郁、厌恶等,严重影响人们的工作、学习和生活,给患者带来难以忍受的痛苦与折磨,甚至使患者产生自杀倾向。痛觉由痛感觉和痛情绪两部分组成,其中痛感觉主要通过对刺激的性质、强度和部位进行判断,而痛情绪主要是疼痛所伴随的不愉快感受。截止目前,临床缺乏有效的治疗手段。因此,全面深入研究疼痛和镇痛的机制,将为新型镇痛药的研发提供重要的理论基础。疼痛的缓解具有奖赏性质。经典的奖赏环路起于中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA),止于前脑边缘的伏隔核(nucleus accumbens,NAc)。VTA 区富含有大量的多巴胺能神经元,还可投射至海马、嗅叶、前额叶皮层、杏仁核。杏仁核作为边缘系统的皮质下中枢,在疼痛调制过程中起了关键作用,尤其是中央杏仁核(central amygdala,CeA),它又被称为“伤害感受性杏仁核”,具有强烈的感觉和情感维度。神经递质、神经肽、激素及相应受体参与杏仁核的疼痛调控。多巴胺(dopamine,DA)作为中脑奖赏系统重要的神经递质,通过相应的多巴胺受体发挥作用。研究表明多巴胺通过5种不同的G蛋白偶联受体发挥作用,包括D1类亚家族(D1R和D5R)和D2类亚家族(D2R、D3R和D4R)。前者与Gs耦联,促进环磷酸腺苷(cAMP)形成;后者与Gi耦联,抑制cAMP形成。研究表明,多巴胺受体在脑内不同的核团中调节伤害感受时作用不同。因此,本课题建立足底切口痛缓解模型,利用光遗传学技术,结合清醒动物的行为学检测,揭示出特异性激活奖赏环路VTA-CeA参与疼痛缓解,杏仁核的多巴胺D2受体(D2R)介导了 VTA-CeA通路减轻疼痛感觉及缓解痛情绪的机制。目的研究激活VTA-CeA奖赏环路是否能减轻疼痛感觉及缓解疼痛情绪;哪种多巴胺受体亚型介导了 VTA-CeA环路减轻疼痛感觉及缓解疼痛情绪。方法本实验先建立小鼠足底切口痛模型,检测术后小鼠的行为学变化。腘窝注射利多卡因(lidocaine)后小鼠疼痛缓解(产生条件位置偏爱);通过免疫荧光检测疼痛缓解时VTA区Fos的表达变化,验证疼痛缓解时VTA区神经元活化;利用示踪技术以及免疫荧光双标相结合的方法,检测VTA与CeA区的纤维投射。利用光遗传学技术激活VTA-CeA通路,检测小鼠痛感觉以及痛情绪的行为变化;通过Western blot检测疼痛缓解时CeA区的D1R、D2R是否发生变化。利用免疫荧光双标技术检测D1R、D2R分别与GABA、Glutaminase的双标情况;最后腹腔给予D2R的激动剂检测光激活后痛感觉、痛情绪的变化,进而验证D2R在VTA-CeA通路中的作用。1.建立足底切口痛(incision)及其缓解模型,采用Von Frey丝、热辐射仪检测痛感觉,采用旷场、高架十字迷宫实验检测痛情绪。小鼠异氟烷麻醉,然后将小鼠左后足用碘伏消毒,铺洞巾后,经过皮肤、筋膜和足底肌肉做0.5厘米的纵向切口,保持肌肉完整性,按压止血后缝合皮肤。假手术(sham)组仅麻醉、消毒。分别于术前,术后6小时,1天,3天,7天检测小鼠的机械痛阈值和热痛阈值,在术后第3天检测焦虑样情绪。在异氟烷轻度麻醉下向腘窝中注入100 ul生理盐水或利多卡因(2%)来实现周围神经阻滞,最后通过条件位置偏爱实验检测小鼠自发痛是否得以缓解。2.采用免疫荧光技术检测疼痛缓解时VTA区神经元的活化情况,采用示踪技术结合免疫荧光双标的方法检测VTA与CeA的纤维联系。足底切口痛小鼠,在异氟烷轻度麻醉下向腘窝中注入100 ul生理盐水(saline)或利多卡因(lidocaine),之后通过条件位置偏爱实验检测小鼠的自发痛行为。分成 sham+Saline,sham+Lidocaine,incision+Saline,incision+Lidocaine 四组,采用免疫荧光技术检测小鼠VTA区Fos的表达变化。正常雄性BL/6J小鼠,异氟烷麻醉,固定于脑立体定位仪上,开颅,用带有玻璃电极的1 μ1汉密尔顿微量注射器将逆行示踪剂荧光金FG(2%,生理盐水稀释)注射于CeA区(前囟后1.22 mm、中线外侧2.3 mm、硬脑膜下4.8 mm),在VTA区观察是否有FG阳性神经元;或者将AAV8-EF1a-DIO-ChR2-mCherry顺行示踪病毒注射于VTA区,在CeA区观察mCherry 阳性的神经纤维。药物注射结束后,为防止外渗,可原位留针10分钟,最后缓慢拔出针头。7～10天后灌注切片在荧光显微镜下直接观察神经元的投射情况。通过免疫荧光双标技术检测FG与多巴胺能神经元的标记物TH的共标,进而证实VTA区多巴胺能神经元投射至CeA。3.采用光遗传学技术激活VTA-CeA通路后观察痛感觉以及痛情绪的变化。首先将 AAV8-EF1 a-DIO-ChR2-mCherry 或 AAV8-EF1 a-DIO-mCherry 病毒注射到DAT-Cre鼠的VTA区,4周后在CeA埋置光纤,埋置光纤后第7天检测小鼠的基础痛阈值,排除置光纤对小鼠疼痛阈值的影响。用符合条件的小鼠制作足底切口痛模型。6小时后采用Von Frey丝检测蓝光激活状态下小鼠的机械性缩足阈值,并开始对小鼠进行条件位置偏爱实验的预处理阶段,3天后通过旷场实验检测蓝光激活状态下小鼠的焦虑样情绪。实验结束后,灌注取材,通过免疫荧光技术检测光敏感蛋白(ChR2)与TH的共标情况,进而验证光敏感蛋白表达在多巴胺能神经元上。4.采用Western blot检测疼痛缓解时CeA区多巴胺受体的表达变化,腹腔注射D2R激动剂结合光遗传学技术进一步检测痛感觉以及痛情绪的变化。正常雄性BL/6J小鼠,经过处理后分为sham+Saline,sham+Lidocaine,incision+Saline,incision+Lidocaine 四组,通过 Western blot 分别检测 CeA 区D1R、D2R的表达变化。通过免疫荧光双标技术检测D1R、D2R、分别与GABA、Glutaminase的双标情况。最后腹腔给予D2R的激动剂检测光激活后的痛感觉以及痛情绪的变化。结果1.足底切口痛模型小鼠产生机械痛敏和热痛敏以及焦虑样情绪。假手术(sham)组,小鼠术后各时间点痛阈值与基础阈值相比无明显变化(P>0.05)。而模型组(incision)小鼠造模后6小时术侧的痛阈值与基础阈值/sham组相比出现明显降低,并至少持续到第3天(***P<0.001)。通过旷场实验和高架十字迷宫实验检测小鼠术后第3天的行为,结果发现小鼠术后出现明显的焦虑样情绪。2.疼痛缓解时VTA区神经元活化,VTA区的多巴胺能神经元可投射至CeA。腘窝给予利多卡因的足底切口痛小鼠(incision+Lidocaine)在利多卡因匹配的腔室停留时间明显高于给予生理盐水(incision+Saline)腔室的停留时间,即产生条件性位置偏爱,表明自发痛得以缓解(**P<0.01)。之后通过免疫荧光标记技术检测sham+Saline,sham+Lidocaine,incision+Saline,incision+Lidocaine四组 VTA 区 Fos 的表达变化。结果发现,incision+Lidocaine 与 incision+Saline组相比,VTA区Fos阳性的神经元数目明显增加(*P<0.05),incision+Saline与sham+Saline组相比,VTA区Fos 阳性的神经元数目无明显变化(P>0.05)。将逆行示踪剂荧光金(Fluoro-Gold,FG)注射至小鼠CeA区,通过荧光显微镜观察发现VTA区存在大量的FG 阳性神经元,通过免疫荧光双标技术显示FG与TH(多巴胺能神经元的标记物)存在大量共标;采用病毒顺行示踪的结果显示,CeA区存在大量mCherry 阳性的神经纤维。结合顺行与逆行示踪的结果表明VTA与CeA存在直接投射,并且是多巴胺能神经元的投射。3.激活VTA-CeA通路可缓解切口痛小鼠的机械痛敏以及焦虑样行为,产生条件位置偏爱缓解自发痛。病毒注射后第4周,光纤置于CeA区,1周后,进行行为学检测。结果显示,注射 AAV8-EF1a-DIO-ChR2-mCherry(AAV-ChR2)病毒的小鼠,有光刺激与无光刺激相比,小鼠术侧机械性缩足阈值出现明显升高(**P<0.01),对侧机械性缩足阈值在有无光刺激条件下均无明显变化(P>0.05)。旷场实验结果发现,注射AAV-ChR2病毒的小鼠,给予光刺激后,小鼠在中央区活动时间占总时间的百分比(center time%)明显增加(**P<0.01)。条件位置偏爱实验显示:AAV-ChR2组小鼠在光刺激匹配腔室的停留时间明显高于无光刺激腔室的停留时间(**P<0.01)。综上结果表明:激活VTA-CeA环路可缓解切口痛小鼠的自发痛、机械痛敏以及焦虑样行为。4.腹腔注射D2R的激动剂逆转了光激活VTA-CeA环路对切口痛小鼠痛感觉和痛情绪的缓解。正常雄性BL/6J小鼠,通过Western blot分别检测sham+Saline,sham+Lidocaine,incision+Saline,incision+Lidocaine 四组 CeA 区 D1R、D2R的蛋白表达变化情况。结果显示:与incision+Saline相比,疼痛减轻(incision+Lidocaine)小鼠CeA区的D2R表达明显下调(**P<0.01),D1R表达无明显变化(P>0.05)。免疫荧光结果显示:D1R主要和Glutaminase共标,D2R主要和GABA共标。给予D2R激动剂(quinpirole)10分钟后再给予光照,蓝光刺激时与D2R+DMSO对照组相比,D2R+quinpirole组小鼠的机械痛阈值明显降低(**P<0.01);蓝光刺激时与D2R+DMSO相比,D2R+quinpirole组小鼠在旷场中央区的停留时间占总时间百分比(center time%)明显降低(**P<0.01);光刺激时,在给予quinpirole的腔室停留时间与给予DMSO的腔室停留时间相比明显减少(*P<0.05)。以上结果表明:D2R激动剂逆转了光激活VTA-CeA通路引起的疼痛缓解。结论激活VTA-CeA奖赏通路可减轻疼痛感觉及缓解疼痛情绪;D2R介导了VTA-CeA通路减轻疼痛感觉及缓解疼痛情绪。