目的:观察TR注射液连续给药大鼠和Beagle犬后对机体产生的毒性反应及其严重程度、主要毒性靶器官及损害的可逆性,找到无毒性反应剂量,为临床设计人用剂量和主要观察指标提供参考。方法:健康SD大鼠80只按体重随机分为0、25、50、100 mg/kg四个剂量组,每组20只,雌雄各半,腹腔注射;健康Beagle犬26只按体重分为0、5、15、45 mg/kg四个剂量组,其中0、5、15 mg/kg组每组6只动物、45 mg/kg组8只动物,雌雄各半,静脉注射给药。每周周一至周六给药,连续给药90天,恢复期为30天。在给药后1小时内监测动物的一般症状及相关指标如食量、体重、呼吸、肛温、瞳孔等。大鼠在给药后第90天(d90,停药期)和第120天(d120,恢复期)每组各1/2大鼠采血测定各组动物的红细胞计数、血红蛋白定量、红细胞压积、红细胞平均容积、红细胞平均血红蛋白容量、红细胞平均血红蛋白浓度、血小板计数、白细胞计数、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、大未染色细胞、网织红细胞计数、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间及血浆纤维蛋白原等血液学指标以及测定血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、总胆红素、尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白、血糖、总胆固醇、甘油三脂、肌酸磷酸激酶,血清钙、磷、血清钾、钠和氯等血液生化指标。犬在给药前、给药后第45天、第90天和第120天检测心率、P波电压、P-R间期、R波电压、QRS时间、ST段、T波电压和QT间期等心电图指标;红细胞计数、血红蛋白定量、红细胞压积、红细胞平均容积、红细胞平均血红蛋白容量、红细胞平均血红蛋白浓度、血小板计数、白细胞计数、白细胞分类、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、大未染色细胞、网织红细胞计数、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间及血浆纤维蛋白原等血液学指标;血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、总胆红素、尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白、血糖、总胆固醇、甘油三脂、肌酸磷酸激酶,血清钙、磷、血清钾、钠和氯等血液生化指标;测试尿液葡萄糖、蛋白质、胆红素、尿胆原、pH、比重、红细胞、酮体、亚硝酸盐和白细胞等尿液指标。在给药后第90天和第120天分别对每组各1/2的动物剖检,进行组织病理学检查及骨髓细胞计数分类。结果:1. TR注射液25 ~ 100 mg/kg连续ip大鼠90天毒性试验:(1)100 mg/kg剂量时对雌性大鼠体重增长有轻微影响。(2)对大鼠血液学指标未见明显影响。(3) 100 mg/kg剂量时可使雌性大鼠d90的肌酐明显升高。(4)对骨髓系统无明显毒性作用。(5)对大鼠主要脏器的绝对重量和相对重量无明显影响。未观察到药物对心、肝、肾、肺、脑等实质器官有显著的毒性作用。(6)对给药部位无局部刺激作用。2. TR注射液5 ~ 45 mg/kg iv Beagle犬90天毒性试验:(1)剂量达45 mg/kg时,给药期间动物四肢僵直、站立不稳、侧卧、流涎、呕吐(胃内容物)、排便、部分动物嚎叫、角弓反张(2只),逐渐安静,1 h左右均可恢复。提示TR对动物消化系统、神经系统和内分泌系统有毒副作用,但作用可逆。药物对Beagle犬体重、肛温、呼吸和瞳孔无明显影响。(2)对ECG无明显影响。(3)对血液学指标无明显影响。(4)对血液生化指标无明显影响。(5)对尿液指标无影响。(6)对骨髓系统无明显毒性作用。(7)病理学检查未发现药物对Beagle犬有明显毒性损伤的形态学证据,无明显血管和肌肉刺激性。结论:(1)TR注射液25 ~ 100 mg/kg连续ip大鼠90天,安全剂量为50 mg/kg,毒性剂量为100 mg/kg,毒性靶器官为消化系统和泌尿系统(肾脏),但毒性作用均为功能性的且可逆;(2)TR注射液5 ~ 45 mg/kg iv Beagle犬90天,中毒剂量为15 mg/kg,严重中毒剂量为45 mg/kg,毒性靶部分为消化系统、神经系统和内分泌系统,但毒性作用均为功能性的且作用可逆。目的:结合TR注射液90天Beagle犬长期毒性试验进行,对Beagle犬中脑组织进行全基因组变化研究,找到TR神经毒性反应的可能机制。方法:取8只受试犬的中脑组织(停药期0 mg/kg剂量组3只,停药期45 mg/kg剂量组4只,恢复期45 mg/kg剂量组1只),提取细胞中的RNA,标记并扩增后与基因表达谱芯片进行杂交,经扫描分析筛选出表达差异的基因,对部分有表达差异的基因进行实时定量PCR(Real-time PCR, RT-PCR)基因验证和免疫印迹法(Western Blot, WB)蛋白验证。结果:(1)芯片杂交信号清晰,背景低,信噪比高。(2)经过T-test检验,筛选出显著上调(信号比值≥2)或显著下调(信号比值≦0.5)的差异表达基因2085个。(3)按照基因功能分类体系(Gene Ontology, GO)分析差异表达基因,结果显示,与生物学过程相关的差异基因共110个,共分16类,如正向调节细胞通讯、调节系统进程、调节多细胞生物过程、调节DNA代谢过程、调节信号传导、蛋白质氨基酸的磷酸化,反向调节生物学过程等。(4)导致药物神经毒性的可能信号通路有:细胞粘附分子信号通路、细胞外基质受体相互作用信号通路、白细胞穿透内皮迁移信号通路、粘着斑信号通路、T细胞受体信号通路、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢信号通路。(5)基因芯片杂交发现表达上调/下调的基因,用实时定量PCR检测也得到同样的结果,说明在基因芯片上发生改变的基因能够被RT-PCR验证出来。(6)TR处理组中的LAMC2蛋白的表达水平比溶媒对照组明显提高,NRXN1蛋白的表达水平比溶媒对照组明显降低,与基因芯片结果吻合。结论:(1)基因芯片检测和聚类分析结果有效;(2)TR的中枢神经毒性作用可能和其以下作用有关:通过调控细胞粘附分子信号通路中的NXRN1等基因导致轴突蛋白的表达量减少,影响神经元之间的突触传递和细胞信号转导;调控细胞外基质信号通路中的LAMC2等基因,使层粘连蛋白表达量上调,影响中枢神经系统的结构和功能;调控粘着斑信号通路中的ITGA6等基因使整合素的表达量下降,从而影响细胞与细胞之间的生物学行为;调控T细胞受体信号通路相关基因影响T细胞受体结构与功能;调控白细胞穿透内皮迁移信号通路导致中毒靶部位的炎症反应;调控对甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢信号通路,影响磷脂酰丝氨酸的合成,造成中枢神经系统损伤。因此TR的神经毒性可能是多条信号通路共同作用的结果。