视网膜色素变性(pigmentary degeneration of the retina, or retinitis pigmentosa,RP )1, 2是遗传性视觉损害和盲目的最常见原因之一,表现为进行性感光细胞及色素上皮功能丧失。其确切病因不明,一旦发病,无论患者自身修复或临床常规治疗均很难逆转该病进程。因此,干细胞治疗成为临床关注的焦点3-6。干细胞是一类能够自我更新,具有多分化潜能的增殖细胞7-9。目前已经发现了大量不同来源的视网膜干细胞( retinal stem cells,RSCs )10-12,其中视网膜缘( ritinal margin,或睫状缘,ciliary margin zone,CMZ )和睫状体平坦部( pars plana of the ciliary body )被认为是视网膜边缘生发区( proliferating marginal region ),是终生具有干细胞存在的部位13。对低等脊椎动物的观察发现,在急性损伤的情况下,生发区干细胞能增殖并分化为新生神经元,替代损伤的细胞11, 14-17。但目前,对于哺乳动物生发区干细胞研究较少,特别是在视网膜变性损伤的情况下,其增殖和变化的规律,尚不清楚。该问题的阐明,将有助于加深对RSCs的认识,了解其在病理变化中的作用。近年来研究发现,多条信号途径参与了干细胞增殖分化的调控19-23,其中Sonic Hedgehog-patched ( Shh/ptc )信号途径是神经发生的关键调控机制,在神经祖细胞的增殖和分化,出生前后视网膜的发育过程中都起了重要的作用18。在体和离体实验均证明24, 25,视网膜和睫状体上皮干细胞/祖细胞表达Shh/ptc通路的关键分子Ptc1、Gli1和Smo,提示Shh/ptc通路可能参与了RSCs的调控。但在视网膜变性的过程中,该信号途径发生了怎样的变化,能否发挥其重要的调控功能,并对生发区干细胞产生影响,目前尚不清楚。该问题的深入探讨,将有助于视网膜退行性变病理机制和RSCs再生的研究,对临床视网膜移植和损伤后的修复治疗亦具有参考意义。基于上述研究现状,本研究采用视网膜冰冻切片和荧光免疫组织化学染色的方法,观察视网膜变性大鼠在自然病程中,视网膜外核层( outer nuclear layer, ONL )厚度的变化,以及视网膜边缘生发区RSCs数量和增殖能力的变化;并通过荧光定量PCR方法检测视网膜边缘生发区Shh/ptc信号途径中关键分子Shh、Ptch1、Smo和Gli1mRNA的表达,分析其表达水平变化与RSCs增殖变化之间的关系,推测其在大鼠视网膜变性以及干细胞增殖中的作用。本研究包括两个部分:第一部分:RCS大鼠视网膜边缘生发区干细胞增殖能力的时空变化RCS大鼠视网膜变性过程中,视网膜外核层逐渐变薄,细胞排列紊乱,大量感光细胞变性死亡。变性晚期( PN 90d ),外核层几乎完全消失,丧失感光功能。同时随着病程的进展,视网膜边缘生发区干细胞和增殖细胞数量逐渐增加,在变性中后期( PN 60d )达到高峰,到了变性晚期( PN 90d ),干细胞和增殖细胞数量再度减少,接近于早期( PN 15d )水平。对照组Long-Evan’s大鼠阳性细胞较少,且随着年龄增加,逐渐消失。与同龄对照组大鼠比较,PN 30d和PN 60d RCS大鼠阳性细胞明显增高,差异非常显著( P﹤0.01 )。第二部分:RCS大鼠视网膜边缘生发区Shh/ptc信号途径的变化及其与干细胞增殖的关系RCS大鼠视网膜变性中后期( PN 60d ),视网膜边缘生发区Shh/ptc信号途径中几个关键信号分子Shh、Ptch1、Smo和Gli1 mRNA表达水平均不同程度上调,到了变性晚期( PN 90d ),其表达水平再度降低。与同龄对照组大鼠比较,PN 60d RCS大鼠亦有不同程度增高,Gli1表达有显著性差异( P<0.05 ),Shh和Smo表达有非常显著性差异( P<0.01 )。在病变过程中,RCS大鼠视网膜边缘生发区Shh/ptc信号途径的变化,与该部位干细胞增殖的变化是一致的,都经历了一个先增加再降低的过程,且峰值几乎都出现在变性中后期,变化曲线较为吻合。本研究结论:1、RCS大鼠随着病程进展,外核层逐渐变薄消失,提示RCS大鼠可以作为一种良好的视网膜变性的模型。2、PN 60d RCS大鼠视网膜变性达到高峰,视网膜边缘生发区干细胞受到损伤刺激,增殖增加。3、RCS大鼠视网膜变性中后期( PN 60d ),视网膜边缘生发区Shh/ptc信号途径出现短暂激活。4、RCS大鼠视网膜退行性变可能通过Shh/ptc信号途径,调控了视网膜边缘生发区干细胞的增殖。