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目的:雄黄（Realgar）是含砷的矿物药,是国家药品监督管理局在《医疗用药毒性药品管理办法》中特别规定的28种毒性中药之一。雄黄临床应用广泛。雄黄主要成分为二硫化二砷或四硫化四砷（As2S2或As4S4）,同时还含有少量三氧化二砷（As2O3,i AsⅢ,即砒霜）,As2S2或As4S4在胃肠道中不易被吸收而直接随粪便排出,而i AsⅢ易被胃肠道吸收,是雄黄的毒性成分。但由于受传统用药习惯（中药无毒副作用）的影响,而未科学（长期、超量和不规范）合理使用单味雄黄或其复方制剂引起的药源性砷中毒事件时有报道,其临床表现为全身多系统损害,以消化系统、皮肤损害为主。已有研究表明,氧化应激和氧化损伤是砷毒性的主要机制之一。Nrf2作为抗氧化因子在抵抗氧化应激中起重要作用。同时MAPK信号通路参与Nrf2的活化。Nrf2活化后,启动下游抗氧化基因表达,包括NQO1、GST、SOD、HO-1和γ-GCS进一步发挥抗氧化作用。牛黄最早记载于《神农本草经》中。临床研究表明,牛黄具有减轻肝脏损伤,保护肝脏作用。许多研究表明,牛黄是天然抗氧化剂,对许多毒物诱导的氧化应激性损伤有明显的拮抗作用。因此,本研究采用体外细胞培养实验的方法,探究MAPK、Nrf2/HO-1通路在雄黄致大鼠肝细胞损伤中的变化,阐明雄黄损害肝细胞毒性作用机制,发现其毒性早期改变及敏感生物学标志物,对于早期采取有效措施预防和控制慢性砷中毒的发生、指导临床合理用药以及提高人口素质具有重要的理论和现实意义。同时,分析牛黄对雄黄的配伍解毒机制,为预防雄黄的肝脏毒性及中医配伍解毒理论的研究提供实验基础及理论依据。研究方法:大鼠原代肝细胞的分离培养与鉴定,建立原代肝细胞体外培养模型。MTT法检测不同浓度雄黄、牛黄以及牛黄预处理后暴露于雄黄中的肝细胞活力,选择合适的雄黄暴露剂量和牛黄保护剂量,并在显微镜下观察其对细胞形态的影响。应用GPX酶活力检测试剂盒,检测不同浓度雄黄提取液对细胞GPX酶活力的影响。采用蛋白免疫印迹法（Western Blot,WB）检测不同浓度雄黄提取液对大鼠原代肝细胞内MAPK（p38、JNK）、Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平的影响,以及不同浓度人工牛黄预处理后暴露于雄黄中的肝细胞内Nrf2、HO-1蛋白表达水平的变化。实验所得数据用均数±标准差表示,应用GraphPad Prism5软件进行单因素方差分析（One Way ANOVA）以及多因素方差分析（Two Way ANOVA）方法进行多组间差异显著性检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1、雄黄提取液在1.25-2.5 mg/m L（w/v）时会引起大鼠原代肝细胞的形态改变及细胞活力降低,并呈剂量反应关系,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）。同时雄黄提取液在1.75 mg/mL（w/v）时,细胞活力接近50%。2、雄黄提取液在1.25-1.75 mg/mL（w/v）时可引起大鼠原代肝细胞的GSH-Px酶活力降低。3、与对照组相比雄黄提取液在1.25-1.75 mg/mL（w/v）时可引起大鼠原代肝细胞内p-JNK、p-p38蛋白表达含量升高。同时Nrf2、HO-1蛋白表达含量都有显著的升高,均高于对照组（P<0.05）。4、对照组相比雄黄提取液在1.75 mg/mL（w/v）时,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达含量有降低趋势（P>0.05）,而凋亡蛋白Bax的表达含量显著升高（P<0.05）。5、人工牛黄提取液在0.10、0.15、0.175、0.20和0.25 mg/mL（w/v）时,对细胞形态及活力的改变与对照组相比无明显差异。但人工牛黄提取液在0.175和0.25 mg/mL（w/v）预处理1 h后的1.75 mg/mL（w/v）雄黄提取液处理的大鼠原代肝细胞中,细胞活力高于1.75 mg/mL（w/v）雄黄提取液处理大鼠原代肝细胞。6、人工牛黄提取液在0.175和0.25 mg/mL（w/v）预处理1 h后的1.75 mg/mL（w/v）雄黄提取液处理的大鼠原代肝细胞中,与1.75 mg/mL（w/v）雄黄提取液组相比Nrf2、HO-1蛋白表达含量有所降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1、雄黄可引起大鼠原代肝细胞活力及抗氧化能力显著降低,造成氧化损伤。其机制与JNK、p38、Nrf2和HO-1的活化有关。2、人工牛黄对雄黄引起的肝细胞损伤有保护作用。其机制为人工牛黄可以抑制雄黄致Nrf2/HO-1信号通路的活化。