研究背景子宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁妇女的生命健康。当务之急是发展和寻找有具有潜力的治疗新手段和方法。增殖细胞核抗原(Proliferating cellnuclear antigen，PCNA)是一种核周期性抗原，出现在所有增殖期的细胞核中。根据Bravo′的研究，PCNA在DNA合成中是绝对必需的，在细胞增殖过程中有重要意义，常高表达于肿瘤中，如卵巢癌、肺癌、唾腺癌，尤其是在子宫颈癌最为常见。以下调PCNA的表达，抑制肿瘤的增殖及凋亡已成为肿瘤靶向治疗的重要策略。之前有报道，利用反义技术特异封闭PCNA的研究，能够明显已抑制肿瘤细胞的增殖，阻滞细胞DNA的合成。目前，应用PCNA分子的拮抗物常见如反义核酸、显性负相突变体等，运用这些技术可明显阻滞细胞分裂、促进细胞凋亡、抑制细胞增殖等。在哺乳动物细胞中能降解同源序列的靶基因的RNA干扰技术，能够在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默。最近的体内外实验证实，RNA干扰(RNAinterfering)技术以其高效性，特异性以及多功能性的优点，显示能够成为肿瘤基因治疗的潜在强有力的方法和手段。在本研究中，我们根据PCNA的cDNA的序列设计小发夹结构RNA(Small-interfering RNA，shRNA)的引物，构建正确的真核表达质粒，导入HeLa细胞中并研究其产生小分子干扰RNA(Small-interfering RNAs，siRNA)对HeLa细胞干预的影响。同时观察其在体内实验中对肿瘤细胞表达PCNA的作用，为RNA干扰技术对肿瘤的基因治疗提供了一定理论和实验基础。目的在了解增殖细胞核抗原的分子生物学及免疫学特性的基础上，我们构建PCNA的shRNA的真核表达载体并在HeLa细胞表达，观察PCNA的shRNA对人HeLa细胞体外增殖的影响及生物学特性的改变。同时利用shRNA质粒介导抑制人HeLa细胞表达PCNA，观察其在体内实验中对裸鼠移植肿瘤生长的影响。方法1．根据PCNA的cDNA的序列设计shRNA的引物，插入真核表达载体pGenesil-1，构建真核表达质粒pGenesil-1-PCNA1-4，并通过酶切和测序等方法进行鉴定，将真核表达质粒pGenesil-1-PCNA1-4转染人HeLa细胞，运用集落形成试验、单细胞凝胶电泳实验观察PCNA的shRNA对人HeLa细胞的生长抑制，免疫组化技术和western blot检测PCNA的蛋白表达，流式细胞仪分析细胞周期变化。2．裸鼠皮下注射HeLa细胞，待形成肉眼可见的皮下肿瘤后，随机分组，分别于肿瘤组织周围进行注射。空白对照组注射生理盐水；阴性对照组注射含无意义序列shRNA质粒；PCNAshRNA组注射含PCNAshRNA质粒；转染试剂Lipofectamine2000组。将稳定表达PCNAshRNA与表达无意义序列shRNA的HeLa细胞，与未转染HeLa细胞分别注射于裸鼠皮下，观察肿瘤成瘤率以及肿瘤生长情况。分别剥离各组移植肿瘤，测量肿瘤组织匀浆上清液测总蛋白含量及PCNA含量。结果1．通过瞬时转染PCNAshRNA，发现PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长，并促进细胞凋亡，阻滞细胞于G0／G1—S期2．裸鼠腋部皮下分别注射未转染、稳定表达PCNA shRNA和无意义序列shRNA的HeLa细胞后，移植肿瘤成瘤率100％。接种HeLa细胞第45天起，三组裸鼠的肿瘤平均体积有显著差异，PCNA shRNA组肿瘤体积低于无意义序列shRNA组与对照组，且无意义序列shRNA组肿瘤平均体积也低于对照组((P＜0．05)。接种第8周末时，PCNA shRNA组肿瘤平均体积比对照组降低。PCNAshRNA组的肿瘤生长到体积为50mm~3的时间比无意义序列shRNA组延迟。PCNAshRNA组的肿瘤倍增时间与无意义序列shRNA组有显著差异((P＜0．05)。PCNAshRNA组肿瘤组织匀浆上清液PCNA含量，比无意义序列组明显降低。PCNAshRNA组肿瘤平均体积比无意义序列shRNA组降低。肿瘤体积的对数回归趋势线分析及对数回归方程分析，显示PCNAhiRNA组的肿瘤生长速率比对照组降低。结论1．本研究成功的构建PCNA的shRNA的真核表达载体并在HeLa细胞中表达，且PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长，其抑制作用是通过阻断PCNA蛋白表达实现2．裸鼠皮下移植肿瘤注射，瞬时转染PCNAshRNA质粒三周，肿瘤生长及表达PCNA量均有明显受到抑制。3．PCNAshRNA稳定表达在HeLa细胞中，在移植瘤模型中可见对肿瘤形成有抑制生长的作用，使得肿瘤细胞增殖至50mm~3的体积所需的时间延长。