痒觉是引起抓挠欲望的一种不愉快的感觉和情绪体验,常伴有搔抓行为。大多数皮肤疾病如特应性皮炎（Atopic dermatitis,AD）、干皮症等常伴有严重的瘙痒症状。随着我国进入老龄化社会,慢性瘙痒的发病率逐年提升。长期的慢性瘙痒可以引起焦虑、抑郁等情绪障碍,严重影响患者的身心健康和生活质量。但目前临床上对大部分瘙痒缺乏高效低副作用的治疗方法。虽然关于痒觉分子机制的研究取得了重要进展,但主要集中在外周和脊髓水平。痒觉信息在脊髓以上中枢如何进行信息传递和调控,研究非常有限,亟待开展高位中枢痒觉神经机制和干预策略方面的深入研究,以期为慢性痒的临床治疗提供实验依据和新靶点。前扣带回皮层（Anterior cingulate cortex,ACC）是端脑边缘系统的重要结构,参与了痛感觉和痛情绪等多种功能的调节。功能影像学研究发现瘙痒状态下,ACC活动明显增强,提示ACC可能参与了痒觉信息调控。研究表明,组胺诱导急性痒行为的过程中,ACC和背内侧纹状体（Dorsomedial striatum,DMS）被激活,ACC-DMS投射通路促进组胺诱发的急性痒。ACC内有大量谷氨酸能神经元和γ-氨基丁酸（γ-Aminobutiric acid,GABA）能神经元,GABA能神经元包括PV、SST等不同的亚群,但ACC内不同类型神经元在痒觉发生发展过程中的具体作用目前尚不清楚。本课题以ACC脑区为研究靶区,运用谷氨酸脱羧酶（Glutamate decarboxylase 2,GAD2）Cre、小清蛋白（Parvalbumin,PV）Cre、生长抑素（Somatostatin,SST）Cre、GAD67GFP等多种转基因小鼠,制备急性痒模型,研究ACC内不同类型神经元在痒觉信息传递和调控中的作用及其机制,为后续深入研究各类神经元可塑性变化及组成的局部环路提供实验依据,最终为开发瘙痒防治药物提供新的干预靶点。第一部分:研究ACC在痒觉信息调控中的作用目的:观察ACC脑区是否在急性痒刺激下被激活,进而明确ACC在痒觉信息调控中的作用。研究方法:1)小鼠颈背部皮内注射组胺（Histamine,His）或氯喹（Chloroquine,CQ）制备急性痒模型,运用痒觉视频追踪系统,检测小鼠的痒行为;2)运用免疫荧光染色技术检测急性痒模型小鼠ACC内c-Fos阳性细胞的分布以及谷氨酸能神经元在组胺或氯喹痒模型中的激活情况;3)运用喹啉酸（Quinolinic acid,QA）化学毁损ACC脑区,观察小鼠急性痒行为的变化。研究结果:1)与小鼠颈背部皮内注射生理盐水对照组相比,小鼠颈背部皮内注射组胺或氯喹诱发强烈的搔抓行为;2)与小鼠颈背部皮内注射生理盐水对照组相比,组胺和氯喹诱发的痒模型中,ACC内c-Fos阳性细胞数量显著增加,谷氨酸能神经元被明显激活;3)局部化学毁损ACC,组胺和氯喹诱发的搔抓次数均显著降低。结论:组胺和氯喹痒模型小鼠ACC神经元激活;ACC毁损后,致痒剂引起的搔抓次数降低,提示ACC对痒觉具有重要调控作用。第二部分:研究ACC内兴奋性和抑制性神经元在痒觉信息调控中的作用目的:观察ACC内兴奋性和抑制性神经元在瘙痒状态下的反应性变化,以及在痒觉调控中的作用和机制。研究方法:1)通过脑立体定位注射使目标神经元特异性表达GCaMP6s,运用在体光纤记录技术观察兴奋性神经元和抑制性神经元在痒刺激下神经元的钙活动变化;2)运用化学遗传学和光遗传学技术研究ACC内兴奋性和抑制性神经元对痒觉的调控作用。研究结果:1)在体光纤记录结果提示,组胺和氯喹痒模型中,钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ）神经元钙信号均上升,GABA能神经元在组胺依赖性痒模型中钙信号明显上升;而非组胺依赖性痒模型（Chloroquine）中则先上升后下降。2)光遗传或化学遗传激活ACC内CaMKⅡ神经元,组胺和氯喹诱发的搔抓次数均显著降低;而抑制CaMKⅡ神经元,搔抓次数则无明显变化。3)光遗传或化学遗传激活ACC内GABA能神经元,组胺诱发的搔抓次数无明显改变,而氯喹诱发的搔抓次数显著增加。抑制ACC内GABA能神经元,组胺和氯喹痒模型小鼠搔抓次数均显著降低。结论:1)ACC内CaMKⅡ神经元在组胺和氯喹痒模型中钙信号均上升,ACC内GABA能神经元在氯喹诱发痒中反应性呈现先上升后下降,在组胺诱发痒中反应性上升。2)光遗传学及化学遗传学结果提示ACC内CaMKⅡ神经元和GABA能神经元均参与了痒觉信息调控,激活CaMKⅡ神经元或抑制GABA能神经元,组胺和氯喹诱发的搔抓次数均显著降低。第三部分:ACC内GABA能神经元的不同亚群细胞在痒觉信息调控中的作用目的:观察ACC内GABA能神经元亚群PV、SST神经元分别在痒状态下的反应性变化,以及对不同致痒剂诱发痒的具体作用。研究方法:1)运用在体光纤记录的方式观察PV和SST神经元在痒刺激下神经元的钙活动变化。2)运用光遗传学技术,激活或抑制PV或SST神经元,观察对组胺依赖或组胺非依赖痒的调控作用。研究结果:1)在体光纤记录结果提示,组胺依赖性痒模型中PV神经元钙信号没有发生改变,SST神经元钙信号上升。非组胺依赖性氯喹痒模型中,PV和SST神经元钙信号均明显上升。2)光遗传激活ACC内的PV神经元,组胺诱发的搔抓次数无明显改变,而氯喹痒模型小鼠搔抓次数则显著增加;抑制ACC内的PV神经元,组胺诱发的搔抓次数无明显改变,氯喹引起的搔抓次数减少。3)光遗传激活ACC内SST神经元,组胺依赖性痒模型搔抓次数无明显改变,非组胺依赖性痒模型搔抓次数则显著增加;抑制SST神经元,组胺依赖性痒模型搔抓次数无明显改变,氯喹诱发的搔抓次数减少。结论:ACC内GABA能神经元的不同亚群PV和SST神经元在组胺依赖性痒和组胺非依赖型痒觉调控中发挥不同的作用。在氯喹诱发痒中PV和SST神经元发挥促痒作用,而在组胺诱发痒中未发挥作用,且未观察到PV神经元钙信号有明显变化,而SST神经元钙信号上升。在体光纤记录结果提示SST神经元可能参与了氯喹诱发痒觉的启动,而PV神经元可能参与了氯喹诱发痒的维持。