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干旱胁迫极大影响着植物的生理生化反应,严重制约着农、林、牧业的产量和种植面积,对我国农牧业可持续发展和粮食安全构成严峻挑战.在干旱胁迫条件下,植物主要通过渗透调节抵抗逆境,脯氨酸是分布最广的植物内源渗透调节物质之一.二氢吡咯-5-羧酸合成酶(△<1>-pyrroline-5-carboxylate synthetase,P5CS)作为谷氨酸途径中的关键酶,催化谷氨酸合成P5C,是合成脯氨酸过程的限速酶.而沙生植物生长在极端干旱的环境中,具有很强的抗旱、耐盐碱、防风、固沙、改良土壤等能力.生长于新疆罗布泊沙漠附近的罗布麻(Apocynum veneturnL)、胡杨(Populus euphratica Oliv),能够合成并积累大量的渗透胁迫调节物质,对干旱胁迫具有极强的耐受能力.因此,本研究以罗布麻、胡杨及甘草为研究材料,从中分离克隆新的P5CS基因,以期为P5CS基因在协助植物抵抗逆境方面的研究提供一定的理论依据,为培育具有稳定抗旱耐早性的转P5CS基因的农作物、林木及牧草新品系奠定基础.主要研究结果如下:
1.针对沙生植物的特点,改进其RNA提取方法,利用同源克隆的方法克隆了罗布麻、胡杨P5CS基因的同源片段.
2.根据获得的罗布麻和胡杨P5CS基因同源片段设计特异引物,利用RACE技术克隆了罗布麻及胡杨的P5CS基因cDNA全长序列,并命名为Avp5cs和Pep5cs.经序列比对分析表明,Avp5cs基因的核酸序列与番茄(SLU60267)Solanum.lycopersicum、彩色猕猴桃(ADU92286)Actidiadeliciosa、桐花树(DQ431113).Aegiceras corniculatum,大豆(AY492005)Glycine max,蒺藜状苜蓿(AJ278818)Medicago truncatula的P5CS基因同源性达到75.40﹪;Pep5cs基因的核酸序列与欧洲葡萄(AJ005686)Vitis.vinifera、乌投叶豇豆(VIRPYRR)Vigna aoonitifolia、大豆(AY492005)G max、番茄(SL,U60267)S.lycopersicum的PSCS基因同源性达到77.63﹪.
3.根据罗布麻及胡杨P5CS基因的特点,利用pBI121载体构建了植物表达载体p-Avp5cs和p-Pep5cs,转化烟草:经kan抗性筛选及PCR,RT-PCR检测获得了7株转Avp5cs基因的烟草阳性植株.
4.通过绘制脯氨酸含量标准曲线获得线性回归方程,利用分光光度法测量植物体内游离脯氨酸,对转基因阳性植株进行不同条件下的脯氨酸含量测定.结果表明,转罗布麻.P5CS基因烟草在正常生长条件下,体内游离脯氨酸含量约为对照烟草的9倍;在逆境条件下,转基因烟草与对照烟草体内游离脯氨酸水平均有较大幅度的提高,而转基因烟草高出对照组约1.5倍.