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猪圆环病毒2型（porcinecircovirustype2,PCV2）可以引发多种疾病，统称为猪圆环病毒病（porcinecircovirusdiseases,PCVD），其中以断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS）危害最为严重。衣壳（capsid,Cap）蛋白是PCV2唯一结构蛋白，与病毒的感染和免疫密切相关，是PCV2疫苗和诊断抗原的靶蛋白。目前，PCV2分为2个主要的基因型（PCV2a和PCV2b）和8个基因群（PCV2b-1A～PCV2b-1C和PCV2a-2A～PCV2a-2E）。由于多克隆抗体可与所有PCV2毒株反应，因此只有一种血清型。最近有人利用单克隆抗体（monoclonalantibody,MAb）证明PCV2-Cap蛋白之间存在抗原性差异。目前为止，囊括PCV2毒株2个主要基因型8个基因群之间的抗原分型相关研究尚未见报道。本研究的第一部分内容是用抗PCV2-Cap蛋白的单抗对不同的PCV2毒株进行抗原分型和Cap蛋白表位竞争性分析。PCV2中和抗体在抵抗PCV2感染的过程中起重要作用，而毒株间Cap蛋白的抗原性差异为研究其构象中和表位提供了条件，因此第二部分内容是鉴定PCV2-Cap蛋白构象中和表位。PCV2感染大多为隐性感染，有必要设计一种可示踪病毒感染和群体免疫水平的标记疫苗，本研究最后一部分内容是探讨PCV2-Cap蛋白为骨架插入外源表位以其构建表位标记毒株。采用抗PCV2-Cap蛋白的单抗对源于2个主要基因型8个基因群的不同PCV2毒株进行了抗原分型和Cap蛋白表位竞争性分析。采用免疫过氧化物酶单层细胞试验（immunoperoxidasemonolayerassay,IPMA）对20株单抗（其中15株单抗源于PCV2a毒株stoon-1010，5株单抗源于PCV2b毒株1147）与14株PCV2毒株（代表8个基因群）之间进行了抗原交叉反应特性分析，得出结果表明，单抗12E12、21C12、38C1和114C8与14个PCV2毒株全部呈阳性反应；单抗19G10除与一株PCV2a-2C毒株不反应外，与其它毒株均反应；单抗48B5除了与一株PCV2a-2C毒株为阴性反应外，与其它PCV2a毒株呈阳性反应；单抗22C1与全部PCV2b毒株反应（除了一株PCV2b-1C毒株）；单抗6E9、9C3、16G12、43E10、55B1、63H3、70A7、94H8和103H7与PCV2b-1A/1B、PCV2a-2A和PCV2a-2E毒株反应；单抗31D5、59C6和108E8只与PCV2a-2A和PCV2a-2E毒株反应；单抗14G2只与PCV2b-1A/1B毒株反应。由此推测，不同PCV2基因群中存在抗原性差异，可利用与广谱性和群特异性单抗的反应特性差异以鉴别不同基因群的PCV2毒株。从20株单抗中选取6株，以PCV2a-2E毒株stoon-1010作为包被抗原，采用竞争ELISA对Cap蛋白进行表位竞争性分析。结果表明，PCV2-Cap蛋白至少存在6个相互重叠的表位，其中，广谱性单抗的表位大于群特异性单抗的表位。基于PCV2-Cap蛋白之间存在抗原性差异来鉴定PCV2构象中和表位的关键氨基酸。采用IPMA和捕获ELISA鉴定，发现单抗8E4仅与PCV2a毒株（CL、LG和JF2）发生特异性反应，而与PCV2b毒株（YJ、SH和JF）无交叉反应。经血清中和试验（serumneutralizationassay,SNA）证实，单抗8E4能够完全中和3个PCV2a（CL、LG和JF2）毒株，却不能中和另外3个PCV2b毒株。采用PCV2感染性克隆和碱基替换/突变技术对PCV2-Cap蛋白构象中和表位的关键氨基酸进行了精确定位。PCV2a/CL株Cap蛋白的第47～72位氨基酸被替换成PCV2b/YJ株Cap蛋白的相应区域，研究结果证实，亲本毒株（PCV2a/CL）与单抗8E4的反应由阳性变成了阴性；进一步碱基替换构建的感染性克隆毒株与单抗8E4进行交叉反应显示，将PCV2a（CL、LG和JF2）-Cap蛋白的第59位丙氨酸替换成精氨酸，这3个毒株与单抗8E4的反应即转换成阴性。PCV2b/48285株的Cap蛋白第59位氨基酸由精氨酸突变成丙氨酸后，同样也可使一部分单抗由阳性反应转换成阴性反应。由此得出结论，PCV2-Cap蛋白的第59位氨基酸是决定其构象中和表位的关键氨基酸。为了构建一种可以示踪病毒感染和群体免疫水平的标记毒株，本研究以PCV2基因组为骨架，在PCV2-ORF2编码的Cap蛋白的C末端插入源自猴副流感病毒5型的V5表位标签（含14aa）。用构建的重组感染性分子克隆转染PK-15细胞，拯救出一株表达V5表位标签的重组毒株，命名为recPCV2/CL-V5。采用IPMA、SNA、捕获ELISA及免疫电镜对重组毒株进行了鉴定。结果表明：在recPCV2/CL-V5感染细胞中分别检出PCV2和V5表位抗原；PCV2阳性血清和中和性单抗1D2能够完全中和recPCV2/CL-V5的细胞感染性；recPCV2/CL-V5在繁殖动力学和形态学上与亲本毒株基本一致。鉴于recPCV2/CL-V5插入了一个V5表位，可以通过PCR、IPMA和捕获ELISA与亲本毒株相鉴别。recPCV2/CL-V5经细胞连续传10代，体外培养增殖性能稳定，病毒效价可达106.25TCID50/mL。通过BALB/c小鼠感染试验证实：亲本毒株与重组毒株均可以在小鼠体内复制并引起肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和胸腺不同程度的病理变化；亲本毒株与重组毒株均可诱导小鼠产生抗PCV2抗体，而且重组毒株可以诱导产生抗V5表位标签的抗体。以上结果表明，将V5表位的基因插入到ORF2终止密码子之前可以将V5表位表达在病毒粒子的表面，而且该表位的插入似乎对病毒的生物学特性没有影响。以上研究为深入探讨PCV2抗原差异的分子基础及其构象中和表位奠定了基础，获得的多株单抗和不同基因型PCV2毒株为PCV2分子诊断技术的研究开辟了新途径，构建的表位标记毒株为下一代新疫苗的开发及鉴别诊断创建了新平台。