目的和意义在2008年,全世界共新增胃癌约989600例,死亡约738000例,占癌症总发生例数的约8%和癌症引起总死亡人数的约10%。相关研究报道显示,70%以上的胃癌新增和死亡病例发生在发展中国家。在中国,胃癌是癌症相关死亡的主要原因之一。众多针对胃癌的研究表明,异常信号通路的活化是胃癌发生发展过程中的一个关键因素。丝裂原活化蛋白激酶-MAPK信号通路在其中发挥了重要的作用,其异常的活化参与了胃癌发生发展的全程。MAPK通路由一个高度保守的家族激酶模块所构成,传递来自细胞外的信号,调控各种细胞的生物学过程,如细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等。MAPK通过其保守特性的T-X-Y功能域中苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化从而被逐级活化。MAPK磷酸酶-MKPs是哺乳动物MAPK信号通路活性的负调控蛋白。MKP家族是由10类来自不同亚群的具有催化活性的酶所构成,其中包括半胱氨酸依赖的双特异性蛋白磷酸酶家族-DUSP家族。双重特异性磷酸酶9基因DUSP9,也被称为有丝分裂原活化蛋白激酶磷酸酶4 (MKP4),是由Muda等在1997年首次发现并进行报道。DUSP9基因是蛋白酪氨酸磷酸酶家族(PTPS)成员之一。它由4个外显子所构成,其mRNA的大小长为8,884 bp,定位于X染色体的q28,编码分子量为41.9kDa的蛋白。在包括胃癌在内的众多恶性肿瘤中,启动子区域DNA发生异常的高甲基化被认为是抑癌基因失活的重要机制之一,抑癌基因的高甲基化主要发生在大多数肿瘤发生发展的早期阶段。上述启动子区域DNA发生异常高甲基化修饰的相关基因涉及细胞周期、DNA修复、细胞-细胞相互作用、细胞凋亡和血管生成等。已有研究表明,DUSP9在肾癌、鳞状细胞癌中表达下调,在消化道肿瘤如大肠癌和肝细胞癌中其表达亦下调。DUSP9对鳞状细胞癌和非小细胞肺癌的抑癌能力在相关的小鼠模型中得到了证实。然而,截至目前为止,没有研究对DUSP9在人胃癌组织中的表达情况进行过检测。此外,没有相关文献对DUSP9在胃癌中失活的分子机制进行报道。本研究采用多例胃癌组织和正常胃黏膜组织。使用重亚硫酸盐处理后的DNA进行亚硫酸盐测序PCR (BSP)分析。在胃癌细胞中通过慢病毒转染过表达DUSP9后,胃癌细胞的增殖能力受到了明显的抑制。材料和方法细胞培养：胃癌细胞株MKN-1、TMK-1、MKN45、 BGC823、NCI-N87、 NUGC3、AGS和MKN-7细胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基进行培养,细胞在37℃、5%CO2以及饱和湿度的条件生长传代,生长状态良好时用于相关实验研究。RNA提取、逆转录及荧光定量PCR：使用TRIzol试剂提取胃癌细胞株和组织中的总RNA。我们使用PrimeScript RT Master Mix试剂盒逆转录500 ng所提取的RNA获得cDNA。实验所用引物由在线软件Primer Bank自动设计生成(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)。相关基因的表达计算方法为2-△△Ct。GAPDH作为内参基因来校正各个基因的表达。每一次检测均进行三次独立重复的实验。亚硫酸氢钠测序检测胃癌组织DUSP9启动子区甲基化情况：临床标本使用蛋白酶K过夜消化后第二天按照常规流程提取DNA。所提取的DNA使用德国Qiagen公司的EpiTect Bisulfite kit进行亚硫酸氢盐处理。PCR产物使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳跑胶来确定PCR产物的唯一性。DUSP9亚硫酸氢钠测序所用引物由在线软件MethPrimer设计生成,产物长为138 BP,产物区中包含11个CpG位点, 测序后结果分析使用NCBI在线BLAST页面http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/进行序列比对。Western blot检测：细胞裂解液是由包含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液制备而成,使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白质的定量。添加好上样缓冲液的蛋白裂解液在10% SDS-PAGE胶中进行电泳,随后转PVDF膜并进行封闭。一抗过夜孵育DUSP9、p21、CDK4、CDK6、CCND1及c-Jun抗体。第二天洗膜后二抗孵育1小时,随后上机曝光并采集图像。皮下成瘤实验：选取BALB/c小鼠进行皮下成瘤实验。收集感染LV-sh-DUSP9的MKN-1细胞及对照组细胞,用无菌PBS重悬至细胞浓度为1×106／ml。取200uI(即含2×105个细胞)用无菌注射器注射于小鼠皮下,密切观察肿瘤形成情况。每1-2d用游标卡尺测量肿瘤大小,密切观察并记录两侧肿瘤生长情况及小鼠的生存时间。肿瘤生长一段时间后适时处死小鼠。载体构建及转染：野生型的真核表达载体由广州赛哲生物科技有限公司所构建,处理组质粒(pEGFP-DUSP9)和对照组质粒(pEGFP-C1)转染使用的是Lipofectamine 2000转染试剂进行转染。包含有G418的培养基进行转染成功细胞的筛选。建立稳定过表达与沉默LV-sh-DUSP9/LV-DUSP9的MKN-1-胃癌细胞株：Lv-sh-DUSP9细胞株是由pLVTHM-GFP慢病毒RNAi表达系统构建而成。慢病毒颗粒用于感染胃癌细胞株MKN-1。对照组和过表达DUSP9组的慢病毒颗粒购于上海吉凯基因化学技术有限公司。按照厂家所提供的操作流程将慢病毒转导至MKN-1细胞构建稳定表达DUSP9的LV-DUSP9细胞株。使用qPCR和Western blot方法检测稳定过表达／干扰DUSP9的效果。针对DUSP9设计的siRNA瞬时转染：针对DUSP9设计的siRNA及其对照均购置于广州市锐博生物科技有限公司。在转染前24小时,MKN-1细胞以30-50%的融合度接种于6孔板或96孔板。采用阳离子脂质体法进行siRNA的瞬时转染,6孔板中每孔siRNA的转染浓度为100nmol/L,操作按TurboFect siRNA试剂说明书进行。细胞在转染48-72小时后进行后续的实验处理。平板克隆形成实验：接种200个MKN-1细胞到6孔板中,在铺板时需保证细胞在培养皿中分散均匀,培养2周。2周后出现肉眼可见的细胞克隆时,弃去培养基终止细胞培养,甲醇固定后使用结晶紫进行染色,在显微镜下计数形成克隆数目,计算方法为：细胞团中细胞数目≥50个细胞为一个克隆。平板克隆形成率=形成克隆的数目／接种细胞数×100%。细胞增殖与细胞周期分析：MTT实验用于检测细胞增殖的能力：将5×103个MKN-1细胞接种于96孔板中,每组5孔,每孔的体积为200 μl,同时设立空白对照组,分别培养24h、48h、72h和96h。在到达培养周期后,每孔加入浓度为5mg/ml的MTT 10 μ l,37℃培养4h后终止培养,小心吸尽孔内的培养基,加入150 μ l二甲基亚砜后室温孵育10min,使结晶物充分溶解,以空白对照为零进行标准化,酶标仪上选择波长为490nm测定各孔吸光度值既OD值,以相对应的OD比值表示细胞增殖能力的强弱。细胞周期分析：收集各实验组的细胞,PBS离心后重悬2次,70%预冷乙醇4℃固定30min,PBS洗一次,按操作说明书加入含10μg/mL PI(碘化丙啶)的染色液,避光孵育15min进行染色并经尼龙膜滤过后,上流式细胞仪检测。每一次检测均进行三次独立重复的实验。结果DUSP9在胃癌细胞系的表达下调。我们首先使用Q-PCR方法检测胃癌细胞株中DUSP9 mRNA的表达。检测结果表明,与正常胃黏膜组织比较,在7株胃癌细胞株中DUSP9的表达水平均发生了下调。接着我们检测了在胃癌各个临床分期中DUSP9的表达水平,我们发现随着肿瘤分期的加重,DUSP9 mRNA的表达明显下调,提示我们DUSP9的表达缺失是胃癌发生发展过程中的早期事件。在胃癌中DUSP9启动子区发生异常的高甲基化。生物信息学分析发现,DUSP9启动子区的CpG岛位于其转录起始位点前1297 BP到其转录起始位点后1104 BP。我们在30例胃癌组织和30例正常胃粘膜组织进行亚硫酸盐测序PCR检测DUSP9启动子区甲基化情况。亚硫酸盐测序PCR检测结果显示,在正常胃粘膜中DUSP9启动子区CpG位点甲基化的平均水平为20.3%,相比之下,在胃癌中DUSP9启动子区CpG位点甲基化水平明显升高,达到了74.5%。为了进一步证实DUSP9 CpG岛异常甲基化是其表达下调的主要分子机制之一,我们使用不同浓度的去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理胃癌细胞株MKN-172小时之后,检测DUSP9启动子区CpG岛甲基化水平及其mRNA的变化。去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理胃癌细胞株MKN-1后,DUSP9启动子区CpG岛甲基化水平明显下调,同时伴随着DUSP9 mRNA表达上调。这一结果提示在胃癌中DUSP9 CpG岛异常甲基化是其表达下调的重要原因之一。体内外实验证实DUSP9能够抑制胃癌细胞的生长。在胃癌细胞株MKN-1瞬时转染DUSP9/对照质粒之后,我们检测了DUSP9对胃癌细胞生长的影响。MTT的检测结果表明,在转染DUSP9质粒后,胃癌细胞株MKN-1的生长率下调了52%,相反的是,在转染Si-DUSP9后,胃癌细胞株MKN-1的生长率下调了74%。在克隆形成的实验结果中,我们发现感染了携带DUSP9慢病毒的MKN-1细胞的克隆形成能力要明显弱于对照组。我们使用慢病毒感染MKN-1细胞使得DUSP9在细胞中稳定过表达,之后我们使用流式细胞仪检测细胞周期的分布。相较于对照组,慢病毒感染的DUSP9过表达MKN-1细胞周期分布更多地是集中在G0/G1期而非S+G2/M期。相反的是,相较于对照组,慢病毒感染的sh-DUSP9过表达MKN-1细胞周期分布更多地是集中在S+G2/M期而非G0/G1期。上述结果提示,DUSP9对细胞生长的抑制作用主要是通过对细胞周期G0/G1期的阻滞作用来实现。我们将感染了Lv-sh-DUSP9的MKN-1细胞及对照组细胞注射到裸鼠皮下成瘤,两周后统计两组移植瘤的生长情况,注射了感染Lv-sh-DUSP9 MKN-1细胞的小鼠成瘤率明显大于对照组,差异有统计学意义。在注射25天之后,注射感染了Lv-sh-DUSP9的MKN-1细胞小鼠瘤荷要明显大于对照组,对照组肿瘤平均体积减小了60%。DUSP9通过调控细胞周期相关分子抑制细胞增殖。第二部分研究结果表明,感染了Lv-sh-DUSP9的MKN-1细胞周期分布更多地是集中在S+G2/M期而非G0/G1期,提示DUSP9对细胞增殖的抑制作用可能是由于诱导细胞周期停滞在G0/G1期所引起。为了进一步阐明DUSP9抑制细胞增殖过程中所涉及的分子机制,我们在MKN-1细胞瞬时转染DUSP9质粒之后使用Q-PCR方法检测了细胞周期相关因子CCND1、CDK6和p21基因mRNA表达变化情况。我们发现MKN-1细胞瞬时转染DUSP9质粒之后,CCND1 mRNA在转染24小时后下调至原来的0.81倍,转染48小时后下调至原来的0.35倍,这一下调的趋势一直延续到转染后72小时。在对CDK4和CDK6基因mRNA的表达水平变化中也观察到相类似的情况。相反的是,在MKN-1细胞瞬时转染Si-DUSP9质粒之后细胞周期相关因子CCND1、CDK6和p21基因mRNA表达出现了不同程度的上调。使用Western Blot方法检测了感染LV-DUSP9慢病毒的MKN-1细胞及对照组中细胞周期相关基因CCND1、c-Jun、CDK4、CDK6和p21蛋白表达变化情况。我们发现,在感染了LV-DUSP9慢病毒的MKN-1细胞中,相较于对照组c-Jun和CCND1蛋白的表达水平显著下调,我们同时也观察到CDK4和CDK6蛋白的表达下调,而在感染了LV-DUSP9慢病毒的MKN-1细胞中p21蛋白表达上调。相反的是,在感染了LV-sh-DUSP9慢病毒的MKN-1细胞中,相较于对照组c-Jun和CCND1蛋白的表达水平显著上调,我们同时也观察到CDK4和CDK6蛋白的表达上调,而在感染了LV-sh-DUSP9慢病毒的MKN-1细胞中p21蛋白表达却发生了下调。为了进一步阐明DUSP9调控细胞周期相关基因表达过程中所涉及的重要信号通路,我们对感染LV-DUSP9/LV-sh-DUSP9慢病毒的MKN-1细胞添加JNK信号通路抑制剂SP600125后,使用Western Blot方法检测细胞周期相关基因CCND1、c-Jun、CDK4、CDK6和p21蛋白表达变化情况。在添加JNK抑制剂之后,DUSP9对MKN-1细胞细胞周期相关基因CCND1、c-Jun、CDK4、CDK6和p21蛋白表达的调控作用要明显降低甚至消失,提示DUSP9对细胞周期的调控与MAPK/JNK信号通路密切相关。结论总之,在人类胃癌中DUSP9基因其启动子区发生高甲基化而导致其表达下调,DUSP9基因能够通过MAPK/JNK信号通路抑制胃癌细胞的增殖。我们同时发现,过表达DUSP9能够显著下调JNK信号通路的活性,而DUSP9对MKN-1细胞细胞周期相关基因CCND1、c-Jun、CDK4、CDK6和p21蛋白表达的调控作用能够被JNK信号通路抑制剂SP600125所阻断。本研究提示,增加DUSP9表达或活性的干预治疗可能活化胃癌细胞内的抗增殖信号通路从而达到治疗的目的。