论文部分内容阅读
研究背景与目的人肝再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration, hALR)是一种具有热稳定性、非特异促进肝细胞再生的细胞因子[1],在肝癌发生、发展过程中发挥重要的作用[2-8]。细胞色素P450酶系是药物代谢中最重要的一个系统,CYP3A4是其中最重要的一种同工酶[9],在人类肝脏和小肠中表达最丰富,与大量药物代谢和不良反应有关[10]。CYP3A4参与50﹪以上目前常用药物在体内的代谢转化过程[11],并在化疗药物的代谢中起重要作用,因此CYP3A4是否与化疗药物耐药有关引起人们的关注。研究表明ALR可以抑制人类原代肝细胞中CYP3A4在蛋白质和mRNA水平的表达,降低其活性[12]。但ALR是否通过影响CYP3A4表达及活性,进而影响HepG2耐药的发生,目前还不清楚。本研究通过体外RNA干扰(RNAi)技术在核酸水平阻断内源性hALR表达,观察HepG2/CDDP中CYP3A4表达和活性的变化,以及HepG2/CDDP对顺铂敏感性的有无变化,从而阐明ALR是通过抑制CYP3A4的表达水平,而参与HepG2/CDDP耐药的发生。方法1.采用逐步递增药物浓度持续诱导方法建立体外HepG2/CDDP细胞系,MTT检测耐药指数[13]。2.将构建好的hALR的siRNA表达质粒psiALR-A及其阴性对照质粒psiALR-B采用脂质体转染的方法分别转染至HepG2/CDDP,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并计算转染效率。⒊根据转染不同的siRNA表达质粒,将HepG2/CDDP分为三组:转染组(转染psiALR-A),对照组(转染psiALR-B),空白组(未转染重组质粒),每组设六个复孔。转染成功以后进行以下研究:免疫细胞化学法、免疫印记法、实时荧光定量PCR法检测各组细胞中hALR和CYP3A4的表达。化学发光法检测各组细胞中CYP3A4的活性,MTT比色法检测各组细胞对顺铂敏感性的变化,每个实验均重复三次。结果1、经历4个月建成HepG2/CDDP耐药模型,其耐药性能稳定,耐药指数为6.26。2、转染24h,HepG2/CDDP细胞内有大量明亮的绿色荧光蛋白(GFP)表达,转染组及对照组细胞绿色荧光蛋白的表达均在70%以上,转染效率高,两组细胞的转染效率基本相同。3、转染48h,各组细胞内hALR在蛋白质水平及mRNA水平表达的变化转染组细胞中hALR表达明显减少,与对照组及空白组比较,P<0.05。而对照组及空白组中hALR表达没有明显差异,P﹥0.05。在蛋白水平及mRNA水平证明hALR的siRNA具有显著的抑制hALR表达的作用。4、转染48h,各组细胞中CYP3A4表达及活性的变化Western blot法、实时定量PCR法及化学发光法分别检测各组细胞中CYP3A4表达及活性变化,发现转染组与对照组及空白组比较,CYP3A4表达水平及活性明显升高,P<0.05,对照组与空白组比较则无明显差异,P﹥0.05。5、转染48h,MTT比色法检测各组细胞对顺铂敏感性的变化结果显示转染组细胞对顺铂的敏感性下降,对照组和空白组细胞对顺铂的敏感性没有明显变化。结论:1、HepG2/CDDP细胞系成功诱导,具有耐药细胞的基本生物学特征。2、脂质体介导的重组质粒psiALR-A及psiALR-B转染,效率较高。3、hALR的siRNA可以显著和特异性的抑制hALR表达。4、阻断hALR的表达,转染组细胞内CYP3A4的表达及活性均明显升高。5、阻断hALR的表达,转染组细胞对顺铂的敏感性降低。