毛乳头细胞(dermal papilla cells,DPCs)在毛囊发育和毛囊周期调控中起主导作用。诱导毛囊形成是DPCs最为显著的功能特征,但是体外培养的毛乳头细胞只有形成凝集性生长后才具有诱导毛囊形成的能力。有研究表明,细胞外基质及毛乳头细胞所分泌的生长因子在毛囊的形成、毛囊周期的调控及毛囊中各系细胞的分化、增殖中均发挥着重要作用,并且细胞外基质的表达与活性受毛乳头细胞分泌的生长因子的调控。因此,研究生长因子和细胞外基质与毛乳头细胞凝集性生长的关系将为毛囊发育、再生及重建提供重要的实验依据。毛乳头细胞具有凝集性生长的特性,但当细胞传代超过六代时这种生物学特性会消失。在实验中我们发现,当培养基pH值超过7.6时,低于六代的毛乳头细胞也会失去凝集性生长特性;当这些细胞用pH值7.2的培养基培养时,其凝集性生长特性又会重新恢复。这一现象说明pH值与毛乳头细胞的凝集性生长特性密切相关,而我们推测这一现象可能是不同pH值培养环境影响了毛乳头细胞的生长因子分泌或细胞外基质的合成,而这些生长因子或细胞外基质中可能存在影响毛乳头细胞凝集性生长的关键因子。因此,我们采用不同酸碱度的培养基培养低代毛乳头细胞,观察不同pH值培养环境下毛乳头细胞生长因子的分泌和细胞外基质的合成与毛乳头细胞凝集性状态之间的关系,从中寻找能够影响毛乳头细胞凝集性生长的关键因素。实验方法第一节:pH值对毛乳头细胞凝集性生长影响1、采用pH6.8、pH7.2、pH7.6和pH8.0四种pH值的培养基培养毛乳头细胞15天,并分别在细胞培养的3,6,9,12,15天,采用MTT法检测毛乳头细胞的增殖能力,采用ELISA法检测毛乳头细胞HGF及bFGF的分泌量。2、采用阿新蓝-雪夫氏染色法检测毛乳头细胞酸性和中性粘多糖的分泌量。3、采用双变量相关分析法对MTT法所测得OD值与凝集团数之间的相关关系,生长因子分泌量与凝集团数之间的相关关系进行分析,若r>0.5,p<0.05说明两组资料之间存在正相关关系。第二节:生长因子诱导高代毛乳头细胞凝集性生长的初步研究1、采用HGF,bFGF,EGF三种生长因子,每种生长因子分别用10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml三种浓度诱导高代毛乳头细胞。2、采用阿新蓝-雪夫氏染色法检测出现了凝集性生长的毛乳头细胞的酸性和中性粘多糖的合成情况。3、采用SPSS12.0分析软件对计量资料进行单因素方差分析,p<0.05时有统计学意义。第三节:HGF与细胞外基质在毛乳头细胞凝集性生长中作用的相互关系的初步研究1、接种于12孔板中的四代毛乳头细胞根据培养基中添加物质的不同分为木糖甙组、木糖甙+HGF、HGF抗体组,同时设DMSO组及阳性对照组各三孔。2、木糖甙用二甲基亚砜(DMSO)稀释,加入培养液后终浓度为1mM。3、采用木糖甙阻断低代毛乳头细胞合成蛋白聚糖的功能4、采用HGF抗体中和低代毛乳头细胞分泌的HGF的作用。5、采用ELISA法检测已用木糖甙阻断其合成蛋白聚糖后的低代毛乳头细胞HGF的分泌量。6、采用雪夫氏及阿新蓝染色法检测与HGF抗体共培养12天的低代毛乳头细胞以及木糖甙+40ng/mlHGF组毛乳头细胞的酸性和中性粘多糖的合成情况。7、采用SPSS12.0分析软件对计量资料进行单因素方差分析,p<0.05时有统计学意义。实验结果:第一节:pH值对毛乳头细胞凝集性生长的影响1、pH7.2和pH7.6培养环境下的毛乳头细胞出现了凝集性生长,而在pH6.8和pH8.0培养环境下的毛乳头细胞未见有凝集性生长出现。2、阿新蓝-雪夫氏染色显示,毛乳头细胞在pH7.2和pH7.6培养环境下既分泌酸性,又分泌中性粘多糖,且这两种培养条件下的毛乳头细胞阿新蓝-雪夫氏染色后的显色情况与阳性对照组的低代毛乳头细胞的染色情况相同,而在pH6.8和pH8.0培养环境下中性粘多糖合成正常,但几乎不合成酸性粘多糖。3、MTT法所测得OD值与毛乳头细胞的凝集团数经双变量相关性分析后,发现反应毛乳头细胞增殖能力的OD值与毛乳头细胞的凝集性生长团数之间无明显相关关系(r<0.5,p>0.05)。HGF分泌量和凝集团数经过双变量相关性分析后,发现毛乳头细胞的HGF分泌量与其凝集性生长团数之间有正相关关系(r>0.5,p<0.05)。第二节:生长因子诱导高代毛乳头细胞凝集性生长的初步研究1、40ng/ml浓度的HGF诱导下的八代毛乳头细胞出现凝集性生长,其它各种生长因子诱导下的毛乳头细胞均无凝集性生长出现。2、阿新蓝-雪夫氏染色结果显示,HGF诱导八代毛乳头细胞形成凝集性生长时,大部分毛乳头细胞胞浆内既有红色又有蓝色,一部分细胞胞浆内则完全为蓝色,还有少部分细胞胞浆内为红色。毛乳头细胞凝集区域内红色和蓝色的显色强度明显强于非凝集区的显色强度,40ng/mlHGF诱导下的八代毛乳头细胞与阳性对照组毛乳头细胞阿新蓝-雪夫氏染色情况基本相同。第三节:HGF与细胞外基质在毛乳头细胞凝集性生长中作用的相互关系的初步研究1、木糖甙组的四代毛乳头细胞无凝集性生长出现。木糖甙+HGF组的四代毛乳头细胞无凝集性生长出现。40μg/mlHGF抗体组的四代毛乳头细胞亦无凝集性生长出现。2、40μg/mlHGF抗体组的四代毛乳头细胞,木糖甙组的四代毛乳头细胞及木糖甙+HGF组的四代毛乳头细胞雪夫氏-阿新蓝染色后中性粘多糖呈阳性而酸性粘多糖均为阴性。3、ELISA检测结果表明木糖甙组毛乳头细胞的HGF分泌量明显少于阳性对照组毛乳头细胞的HGF分泌量(p<0.05)。木糖甙组与20μg/mlHGF抗体组毛乳头细胞的HGF分泌量在各时间点上均无明显差异(p>0.05)。结论1、HGF与毛乳头细胞的凝集性生长有较大相关性,毛乳头细胞的增殖能力与毛乳头细胞的凝集性生长无相关性。2、HGF能够诱高代毛乳头细胞出现凝集性生长。3、酸性粘多糖是乳头细胞形成凝集性生长的物质基础,HGF是通过细胞外基质中的酸性粘多糖对毛乳头细胞的凝集产生作用。4、毛乳头细胞培养环境的最佳pH值范围是pH7.2-pH7.6。