研究背景：创面愈合是各种急慢性创伤治疗的最终目的,在这个复杂的生物学过程中,涉及了多种组织细胞、胞外基质成分以及各种调控因素的参与。目前对于创面愈合的确切机制尚未完全阐明,创面修复的效果尚不能令人满意。创面愈合的分子机制是近年来学者们研究的热点,如能在基础理论方面深化对创面愈合分子机制的认识,就可能为治疗提供新的思路,对提高创面愈合的速度和质量具有重要意义。胶原、纤维连接蛋白(Fibronectin, Fn)等细胞外基质(extracellular matrix, ECM)在创面愈合过程中的作用近年来受到国内外学者的广泛关注。它们在创面中一方面起着填充和支架作用,另一方面ECM还能通过作用于细胞膜上的整合素受体,通过整合素信号通路来调节细胞的增殖、迁移、凋亡等细胞生物学功能。整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)是近年来新发现的一种胞内蛋白激酶,它是整合素通路的关键激酶。除了介导整合素通路的信号传导外,ILK还能通过PINCH作用于生长因子信号通路,介导整合信号通路和生长因子通路的相互作用,另外ILK还在调节细胞骨架蛋白的合成、组装等方面起着重要作用。目前国内外学者关于ILK的研究主要集中在肿瘤和组织纤维化疾病的发生、发展过程,也有学者发现ILK在参与了肝脏、心肌、神经等组织器官损伤后的修复过程,但ILK在皮肤创面愈合过程中的作用和机制国内外尚未见相关研究。故本研究以探讨ILK在创面愈合过程中的作用和机制为目的,首先通过观察ILK在创面愈合过程中的表达情况了解ILK是否参与创面愈合的过程,并且进一步研究TGF-β1对ILK表达的调控作用、ILK对创面收缩和创面ECM合成的影响,试图初步探讨其在创面愈合过程中的作用机制。第一章ILK在SD大鼠皮肤烫伤创面愈合过程中的表达研究目的探讨大鼠烫伤创面愈合过程中ILK和β1整合素的表达以及在创面愈合中的作用方法健康雌性SD大鼠18只,随机选取其中15只作为实验组,建立深Ⅱ度烫伤模型,另外3只为对照组,不做处理。实验组分别于烫伤模型建立后第1、5、10、15、20天随机选取3只大鼠,切取背部两侧全层创面,运用免疫组织化学的方法检测创面中ILK、β1整合素的表达。对照组取背部正常皮肤作为对照。结果烫伤后第5、10、15天大鼠烫伤创面中ILK的表达明显高于烫伤前和愈合后(P<0.05);创面中β1整合素的表达在烫伤后第5天明显高于烫伤前(P<0.05),烫伤后第10、15天则明显高于烫伤前和愈合后(P<0.05)。结论ILK、β1整合素在大鼠创面愈合过程中表达明显增加,ILK可能通过参与整合素信号通路,在调节创面细胞的增生以及细胞与ECM相互作用中扮演着重要的角色。第二章TGF-β,对人皮肤成纤维细胞中ILK表达的调控作用研究目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)对人皮肤成纤维细胞中ILK表达的调控作用。方法7例人正常皮肤标本采用组织块法分离培养人皮肤成纤维细胞,选取第4-6代状态良好的细胞,TGF-β1组给与TGF-p1(5ng/ml)刺激,同一成纤维细胞作为对照,运用倒置相差显微镜观察细胞的形态变化,荧光标记的免疫细胞化学方法检测第24、48、72小时各组细胞中ILK的表达。结果随着刺激时间的延长,TGF-β1组细胞中ILK的表达逐渐增加,第48、72小时TGF-β1组ILK阳性表达的平均光密度值显著高于对照组(P<0.05)。结论TGF-β1能时间依赖地诱导ILK的表达增加,它对皮肤成纤维细胞中ILK的表达具有一定的调控作用。第三章ILK对人皮肤成纤维细胞构建的FPCL收缩的影响及机制研究目的探讨ILK对人皮肤成纤维细胞构建的FPCL收缩的影响和机制。方法①运用7例4-6代人正常皮肤成纤维细胞构建FPCL,每例分为3组。LY294002组FPCL在含FCS 10%、LY2940029i(溶于DMSO)50mmol/L的DMEM培养液中培养,DMSO组FPCL在含FCS10%、仅含DMSO的DMEM培养液中培养,对照组FPCL在仅含FCS10%的DMEM培养液中培养。分别于FPCL形成后第24、48、72、96、120天拍照,运用Image pro plus软件计算凝胶面积和收缩率。②分别运用ILK siRNA 100pm和200pm转染相同成纤维细胞,以ILK con-siRNA转染作为阴性对照,未转染细胞作为正常对照。于转染后48h运用Western blot印迹法检测各组ILK、α-SMA的表达。结果三组FPCL均出现不同程度的收缩,第24h和48h LY294002组FPCL收缩率明显低于对照组(P<0.05),第72h、96h和120h FPCL收缩率明显低于对照组和DMSO组(P<0.05);ILK siRNA 200pm转染组ILK和a-SMA蛋白表达水平与对照组和ILK con-siRNA转染组相比均显著降低(P<0.05表2,图4)。结论运用LY294002阻断ILK-AKT通路后可明显抑制人皮肤成纤维细胞构建的FPCL收缩；人皮肤成纤维细胞中ILK和a-SMA蛋白的表达成正相关。第四章ILK对人皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原、FN表达的影响目的探讨ILK对人皮肤成纤维细胞细胞外基质蛋白Ⅰ、Ⅲ型胶原、FN表达的影响方法以7例人正常皮肤分离培养的成纤维细胞为研究对象,实验分为3组,。ILK cDNA转染组：运用ILK cDNA表达质粒转染人皮肤成纤维细胞；空质粒转染组：运用空质粒转染人皮肤成纤维细胞；空白对照组：只用含10%FCS的DMEM培养液进行培养。在转染后48h,运用实时荧光定量PCR检测细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原、FN mRNA的表达。结果ILK cDNA转染组ILK mRNA的表达水平较其它两组显著提高(P<0.01); ILK cDNA转染组成纤维细胞中FN和Ⅰ型胶原表达明显高于对照组和空质粒转染组(P<0.05)；ILK cDNA转染组Ⅲ型胶原的表达水平也较对照组和空质粒转染组高,但其差异无统计学意义(P>0.05)。结论ILK可在转录水平上调节人皮肤成纤维细胞中胶原基质和FN的表达。