乙型肝炎是目前我国流行最广泛、危害最严重的传染病之一。目前全球乙肝携带者大约有3.5亿人，而我国乙肝携带者就有1.2亿以上，每年有200多万例的急性肝炎发生，因肝病死亡的人数约35万，其中一半是原发性肝癌。由于没有治疗乙肝的特效药物，所以控制乙肝病毒感染及传播的有效措施是接种乙肝疫苗。随着乙型肝炎病毒基因组DNA的克隆和全序列的测定，乙肝病毒表面抗原（HBsAg）基因已相继在大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞和昆虫杆状病毒体系中表达。其中产业化的有两种：酵母及CHO细胞。但由于价格因素，仍不能普及使用。因此人们探索用植物细胞表达HBsAg，希望获得更加低廉、高效的疫苗。本研究基于基础研究的深入和技术手段的成熟，将植物基因工程技术和植物组织细胞培养技术巧妙地结合起来,通过基因转化的方法获得了能够表达乙肝病毒表面抗原的人参愈伤组织细胞。迄今为止，国内外尚无利用人参细胞培养方式生产疫苗的报道。本研究以C28细胞株中基因组DNA作为模板，通过PCR扩增得到乙肝病毒表面抗原S基因；将该基因连接到pMD18-T载体上得到克隆载体pMDBS；经Pst I和Sst I双酶切消化后，琼脂糖凝胶电泳片段<WP=135>大小与理论计算值接，得到含有乙肝基因的植物细胞表达载体质粒pBIBSa。利用基因工程技术把外源基因导入一致，序列测定结果与C28细胞株中S基因相符；用Xho I消化克隆载体pMDBS质粒后，用T4DNA聚合酶进行填平粘末端反应，再用Sst I消化后,回收片段与SstI和SmaI双酶切消化后的植物细胞表达载体pBI121的载体片段连植物细胞是现代植物遗传工程的重要途径。目的基因转化，并整合到受体植物细胞基因组中是其中的主要环节，经过十多年的研究已建立了多种基因转化系统，获得了一批有价值的工程植株。根瘤农杆菌Ti质粒基因转化系统是目前应用研究最多、理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化途径。本研究将表达载体质粒pBIBSa转化到农杆菌LBA4404中，经预培养后，与人参愈伤组织细胞在67V-AS培养基上进行共培养转化；48-72小时后用500mg/L的氨苄青霉素水洗涤以除去未转化的农杆菌，滤纸吸干，再转移至含300mg/L氨苄青霉素的67-V固体培养基上；培养1周后，转移至含300mg/L氨苄青霉素、50mg/L G418的67-V固体培养基上；培养2-4周后，挑取在抗生素培养基上继续生长的细胞到新的培养基上，每2~4周传代培养一次。3-4个月后，转移至35mg/L G418的67-V固体培养基上继续培养，每2-4周传代培养一次。6个月后转移至不含抗生素的67-V固体培养基上，每2-4周传代培养一次，获得稳定生长的转化体细胞。同时建立了固体培养和悬浮培养两种细胞培养系统，将该细胞系命名为CS83细胞系。外源基因编码蛋白质在转基因植物细胞中能够正常表达出应有的功能是植物基因转化的最终目的。表达应具有一定的稳定性，不被细胞内的蛋白酶迅速降解，同时应对植物细胞无毒性。本研究分别应用ELISA法测定每克固体培养的CS83细胞中约含HBsAg124ng，占细胞可溶性蛋白的0.006%。在悬浮培养CS83细胞的培养液及CS83细胞蛋白提取液中均检测到HBsAg。应用Western<WP=136>杂交方法检出转印膜上HBsAg，参照蛋白质分子量Marker判断其分子量大小约2.5KDa。固体培养细胞的免疫组织切片染色观察到HBsAg主要分布在转基因细胞的细胞膜上，细胞核中也有少量表达。对细胞进行冻干、干燥、低温保存后，检测HBsAg水平，其中冻干保存效果最好，明显优于其它保存方法。实验结果表明，本研究建立的CS83细胞系能够稳定表达特异性HBsAg。植物细胞生产疫苗的应用，首先要确定植物细胞产生的蛋白质能否在动物中诱导免疫应答。本研究在腹腔注射CS83细胞研磨液免疫小鼠的实验中，设立了相同剂量的商品化基因工程乙肝疫苗组和基因工程乙肝疫苗原液稀释液组。注射剂量略低于半数有效量，为每只小鼠40ng。实验结果表明注射CS83细胞研磨液的小鼠血清阳性率为5/8，高于50%；注射商品化基因工程乙肝疫苗的小鼠血清阳性率为3/8，低于50%；而注射基因工程乙肝疫苗原液稀释液的小鼠血清中都没有检测到HBsAb。淋巴细胞转化试验中，注射CS83细胞研磨液的小鼠脾细胞增殖水平略高于其他组；脾细胞诱生上清中的IL-2和IFN-γ检测结果，各组间没有明显差异。口服给药的试验中，免疫CS83细胞的3只家兔中有2只检测到了血清抗体。本研究建立的CS83细胞系不仅可以产生重组的HBsAg抗原，而且可以同时产生具有疫苗佐剂作用的人参皂甙。因而在制备疫苗过程中，无需纯化，也不用额外添加疫苗佐剂，大大降低了生产成本。综上所述，本研究建立的CS83细胞系能够表达HBsAg，该抗原能够诱导小鼠产生有效的免疫应答，但表达量及免疫应答水平仍有待于提高。本研究为利用植物组织培养技术表达和生产医用重组蛋白提供技术平台，为其它珍稀药用植物开发利用、组织培养及表达重组蛋白应用奠定了坚实基础。利用植物细胞作为疫苗生产系统的研究在抗原蛋白表达，生物活性<WP=137>分析，动物实验和人体实验方面都取得了重要进展。随着植物基因工程技术、分子生物学、免疫学等研究的不断深入，利用植物细胞生产商品化疫苗将成为可能，这将为多种传染性或非传染性疾病的预防和治疗