目的：过继性细胞免疫治疗（Adoptive cellular immu- notherapy, ACI）是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞（特异性的和非特异性的）直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，以达到治疗肿瘤目的的一种生物治疗方法。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，CIK）是一种新型的免疫杀伤细胞，是ACI研究的热点之一。胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，CIK细胞对胃癌抗肿瘤作用的研究目前尚未见报道。本实验研究通过动态观察正常人CIK细胞的体外增殖及其生物学特性，研究其对多种具有不同生物学行为的人胃癌细胞株的体外细胞毒活性以及对胃癌裸鼠腹膜移植模型的体内抗肿瘤作用，并观察CIK细胞体内外杀瘤过程中细胞因子白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和肿瘤细胞癌胚抗原（Carinoembryonic Antigen，CEA）含量的变化，探讨该新型过继免疫疗法对胃癌抗肿瘤的作用机制，为CIK细胞进一步应用于临床提供理论依据。 方法：1 CIK细胞的制备及体外扩增：取正常人的外周肝素抗凝<WP=4>血，经淋巴细胞分层液密度梯度离心分离外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC），依据不同时间分别加入抗CD3单克隆抗体（anti-CD3McAb）、白细胞介素-1α（IL-1α）、IL-2、IFN-γ等细胞因子，体外诱导成CIK细胞；另外用PBMC在体外同时加入抗CD3McAb和IL-2诱导产生抗CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞（anti-CD3 McAb activited killer，CD3AK）作为对照。以上培养细胞常规培养、传代。并用台盼蓝拒染法计数细胞，动态观察CIK细胞的体外增殖活性。2 CIK细胞表型的测定：分别取不同时段的CIK细胞进行间接免疫荧光抗体染色，用流式细胞仪对CIK细胞的CD3、CD4、CD8、CD16、CD25、CD28、CD56作动态表型分析。3 CIK细胞体外对多种具有不同生物学行为胃癌细胞的细胞毒活性测定及其对OCUM-2MD3杀瘤前后肿瘤细胞CEA含量的检测：3.1将CIK和CD3AK细胞分别以不同效靶比（Effort﹕Target, E﹕T）加入培养K-562、BGC-823、HGC-27、OCUM-2MD3的96孔板，每组3复孔，并常规设相应空白对照，放置于37℃，5%CO2孵箱中培养24小时后，四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法测定分光光度值（OD），计算杀伤活性。3.2利用放射免疫法方法测定CIK细胞对人胃癌OCUM-2MD3细胞杀瘤前后培养上清液中肿瘤标志物CEA的变化。4 CIK细胞对人胃癌OCUM-2MD3裸鼠腹膜移植模型的<WP=5>体内抑瘤作用及其血清、腹水中肿瘤标志物CEA含量的影响：在Balb/c nu/nu裸小鼠腹腔内接种人胃癌OCUM-2MD3高侵袭转移瘤细胞5×106/0.2 ml/只，建立人胃癌裸鼠腹膜移植模型。将荷瘤鼠随机分为3组：生理盐水（NS）对照组（10只）、CD3AK细胞组（10只）和CIK细胞治疗组（12只），CD3AK组和CIK治疗组分别腹腔内注射体外培养14天的CD3AK细胞和CIK细胞，注射量均为4×107/0.2 ml/只，NS 对照组按相同条件腹腔内注射NS 0.2 ml/只，每组均隔日一次，共三次。第7天分别测量体重和腹围；眼眶取血分离血清，采血后引颈处死小鼠，立即解剖计腹水量。用放射免疫方法检测各组裸鼠血清和腹水中CEA的含量。5 CIK细胞中IL-2、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF等细胞因子的分泌及其对OCUM-2MD3细胞株体内外杀瘤时的影响5.1 CIK细胞中IL-2、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF的分泌：分别取不同时段CIK细胞的培养上清液0.5ml，用放射免疫的方法检测中IL-2、TNF-α的变化，用酶联免疫的方法检测其培养上清液中IFN-γ、GM-CSF的变化；5.2 CIK细胞中IL-2、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF对OCUM-2MD3细胞株体外杀瘤过程中的影响：取E﹕T为25﹕1时CIK细胞杀瘤24小时后的培养上清液0.5ml，分别用放射免疫、酶联免疫的方法检测IL-2、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF的变化；5.3 CIK细胞对OCUM-2MD3荷瘤鼠杀瘤过程中血IL-2、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF的影响：取CIK治疗组和NS<WP=6>对照组荷瘤鼠的血清0.5ml，用放射免疫、酶联免疫的方法检测IL-2、TNF-α、IFN-γ、GM-CSF的变化。结果：1 PBMC在体外培养中按一定时间和顺序加入抗CD3MCAb、IL-1α、IL-2、IFN-γ后，能获得大量增殖，CIK细胞在培养两周左右达96×106/ml，至21天左右达115×106/ml，约115倍，CD3AK细胞也获得大量增殖，约104倍，二者相比CIK细胞增殖速度和增殖数量稍高，但无统计学差异（P＞0.05）。2 CIK细胞表型分析表明，CD3+CD56+双阳性细胞在培养过程中百分含量呈大幅上升，其绝对数量由0.02×106个增高到第14天的23.1×106个，达1155倍。CD4-CD8+细胞也呈增长趋势，达288倍。3 CIK细胞的体外细胞毒实验结果表明，与CD3AK相比较，CIK细胞在不同E﹕T时对K562细胞和胃癌细胞BGC-823、HGC-27、OCUM-2MD3均有明显杀伤作用（P＜0.05），提示其杀瘤谱广且细胞毒活性无主要组织相容性符合体（MHC）限制性； E﹕T=50﹕1、25﹕1时CIK细胞对OCUM-2MD3肿瘤细胞作用后上清液中CEA含量较作用前明显降低（P＜0.05），而E﹕T=12.5﹕1时则无明显差异（P＞0.05），与CD3AK细胞比较，二者也有差异（P＜0.05），CIK细胞?