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P2X7受体是嘌呤-配体门控离子通道受体家族P2X的一员。P2X7受体主要表达在上皮细胞和免疫系统细胞如淋巴细胞,肥大细胞,巨噬细胞,参与免疫调节的过程,如炎性细胞因子释放,膜融合以及细胞凋亡。一些研究表明,P2X7受体可能是治疗各种神经退行性疾病、类风湿关节炎、神经性疼痛的靶标。
本研究构建了表达P2X7受体的稳定细胞系,比较多种基于细胞的高通量药物筛选方法,以期能找到最适宜P2X7受体高通量药物筛选方法。利用基因合成技术,得到人源P2X7受体编码基因,构建了人源P2X7受体表达载体(pcDNA3.1-Hygro(+)/hP2X7R)。将人源P2X7受体表达载体转染人胚肾(HEK-293)细胞,抗生素筛选稳定表达人源P2X7受体的细胞系,选取RT-PCR方法检测人源P2X7受体mRNA的转录水平,应用全细胞膜片钳技术检测人源P2X7受体电生理特性。利用荧光成像分析系统(FlexStation),针对人源P2X7受体特性,我们建立了三种高通量荧光检测方法用于检测P2X7受体高表达细胞系药理学特征,分别是膜电位检测方法,溴化乙啶内吞榆测方法和钙内流检测方法。通过对三种不同方法的比较,我们选定钙内流检测方法,同时优化了实验条件,包括缓冲液的优化及DMSO耐受性检测。考察模型的稳定性,并评估应用于96孔板及384孔板进行高通最筛选的可靠性及准确性。综上所述,本研究取得的进展包括:1.合成得到人源P2X7受体基因;2.筛选得到稳定表达人源P2X7受体的细胞系;3.检测人源P2X7受体的电生理特性;4.建立并比较了三种高通量荧光检测方法-膜电位检测方法,溴化乙啶内吞检测方法和钙内流检测方法;最后,我们优化钙内流方法,得到了一个稳定,灵敏,通过Z因子检测,spiking检测,完全符合高通量筛选需求的稳定表达人源P2X7受体的细胞模型。