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摘要:叶绿素降解是植物叶片衰老和果实成熟的最鲜明特征,近年来关于叶绿素降解的生物化学途径已经逐渐明晰,然而对于衰老进程中叶绿素快速降解的遗传调控机理却知之甚少。本研究以模式植物拟南芥为材料,对快中子诱变的M2代Col-0进行遗传筛选,获得了一个滞绿(stay-green)突变体nyel-1(NON-YELLOWING1-1)。nye1-1在叶片衰老时叶绿素降解受阻,同时,叶绿素结合蛋白的降解也显著受到抑制,但是光合速率下降以及衰老基因的表达同野生型无异,表明nye1-1是C类非功能型的滞绿突变体。酶活分析表明nye1-1中叶绿素酶的活性不受影响,而脱镁叶绿酸a氧化酶(PaO)的活性有所下降,但是HPLC分析表明nye1-1中叶绿素酸酯以及PaO的底物脱镁叶绿酸并没有显著积累。遗传分析表明nye1-1是一个半显性突变体,利用图位克隆的手段,我们发现nye1-1是At4g22920基因的一个无义突变(L10＞stop),互补实验进一步证实了这一结果。过量表达NYE1可导致不同程度的叶片黄化,甚至产生白化苗,定量PCR结果显示其叶片黄化程度与NYE1表达量成正相关。这些结果表明NYE1是叶绿素降解的正调节因子。NYE1受各种衰老信号诱导,编码一个全新的叶绿体蛋白,在植物中高度保守。其中NYE2是拟南芥中NYE1的一个潜在同源基因,其相似性在75%左右,因此我们猜测它们可能具有类似的功能,然而其T-DNA插入突变体nye2-1并不显著影响衰老过程中叶绿素的降解,但是利用地塞米松诱导表达系统在野生型和nye1-1中过量表达NYE2则发现诱导两天后即可观察到不同程度的叶片黄化。这一结果为NYE2参与叶绿素降解提供了线索,进一步分析nye1-1/nye2-1中叶绿素降解将有助于阐明NYE2在叶绿素降解过程中的作用和地位。尽管NYE蛋白在植物界中高度保守,但是其蛋白序列没有已知的结构域,这给它的功能预测带来了困难。获得更多的滞绿相关基因资源将有助于从另一个角度去探索叶绿素降解的调控机制,也为研究NYE1/2的功能提供更多的线索。对叶绿体定位的衰老相关基因进行表达谱分析获得了若干与NYE1表达模式极为相似的基因,进一步对这些基因的T-DNA突变体进行鉴定和表型分析,我们获得了一个新的滞绿突变体crn1-1(Co-rogulated withNYE1),CRN1同NYE1一样,都具有N末端的叶绿体定位信号,生物信息学分析表明CRN1编码一个脂肪酶(EC3.1.1),因而猜测其可能具有类似叶绿素酶的活性。与nye1-1一样,crn1-1在多种叶片衰老条件下均表现出滞绿的特征,通过对离体叶片在黑暗处理下的叶绿素降解分析,发现crn1-1中叶绿素降解受阻程度和acd1-20中的相仿,而较nye1-1中的严重。对黑暗处理的离体叶片进行光系统Ⅱ光化学效率(Fv/Fm)的检测则发现从第二天开始crn1-1中光化学效率较野生型和nye1-1中相比下降更为迅速,这不仅表明crn1-1是非功能型的滞绿突变体,而且提示CRN1还可能对叶片衰老过程中光合能力的维持起到保护作用。SDS-PAGE和Western Blot结果表明,在黑暗诱导衰老4天后,crn1-1中Rubisco大亚基正常降解,而叶绿素结合蛋白的降解却受到不同程度的受抑。蓝绿温和胶电泳结果显示这其中最主要是LHCPⅡ三聚体的解聚出现了问题。比较分析叶绿素降解相关突变体中蛋白降解情况表明叶绿素降解和叶绿体-蛋白复合物的降解通常是耦联的,不同叶绿素降解相关基因在其中共同发挥作用,但作用方式有所差异。利用酵母双杂交技术,我们对叶绿素降解相关蛋白的互作关系进行了初步探索,结果表明这些蛋白之间均没有互作关系。总结,本文结合正向遗传学和反向遗传学在拟南芥中鉴定了三个叶绿素降解相关的基因NYE1、NYE2以及CRN1,并对它们在叶绿素和叶绿素结合蛋白的降解中的作用进行了初步的探索和讨论。