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肺动脉高压(Pulmonary hypertension,PH)是一种病因复杂、发病机制不清楚的渐进性疾病,也是仅次于高血压和冠心病的第三位心血管疾病。该疾病恶性程度非常高,约75%的患者在诊断后5年内死亡,症状出现后的平均生存期为1.9年,又被称为心血管中的“癌症”。然而因为其病因和发病机制多样性,病人的临床表现、组织学特征、严重程度、对治疗的反应以及预后都存在很大差异。因此需要开展广泛而深入的研究来攻克该疾病,研究过程中的一个重要环节是肺动脉高压动物模型的建立,该模型的建立有多种方法,包括慢性缺氧(Chonric hypoxia,CH)诱导肺动脉高压模型、野百合碱(Monocrotaline,MCT)诱导肺动脉高压模型、野百合碱(MCT)加肺切除诱导肺动脉高压模型、Sugen5416加慢性缺氧(CH)诱导肺动脉高压模型等。其中MCT模型因为具有操作简单(单次皮下或腹腔注射)、时间短(2周就能形成肺动脉高压)、稳定性好、成本低等特点,使其成为最被广泛运用的肺动脉高压模型之一。但是该模型的分子机制却一直不清楚。野百合碱(Monocrotaline.,MCT)是主要存在于豆科猪屎豆属植物中的11元大环生物碱。其被摄入体内到达肝脏后,在肝脏细胞色素P450的催化作用下代谢成为活性形式:脱氢野百合碱(Monocrotaline pyrrole,MCTP)。通过回顾前期关于MCT的研究发现,其代谢物MCTP与蛋白质、DNA等亲核大分子物质的结合被认为是MCT毒性的重要机制。在细胞中,MCTP主要是与蛋白质的巯基结合,包括肌动蛋白、半乳凝素、蛋白二硫键异构酶、细胞骨架肌凝蛋白、ERp57等,研究表明MCTP对蛋白蛋白中的Cys-Xaa-Xaa-Cys(CXXC)这一特定短肽序列有高度亲和性,被结合的蛋白多含有这一短肽序列,另外有研究发现除半胱氨酸外MCTP还能够与组氨酸、色氨酸形成共价键而结合,如网钙结合蛋白1,3和线粒体ATP合成酶[1-4]。而近几年越来越多文献报道细胞外钙敏感受体(Ectracellular calcium-sensing receptor,CaSR)在肺动脉高压疾病的发生发展中发挥着重要作用[5-7],而通过对CaSR的结构分析发现,CaSR细胞外域(Extracellular domain,ECD)含有19个半胱氨酸、13个组氨酸、10个色氨酸以及3个CXXC短肽序列。综上所述,CaSR的结构特点可能使其成为MCT作用的重要靶点。因此本研究旨在以CaSR作为切入点,对MCT诱导肺动脉高压动物模型的分子机制进行探究,以期为肺动脉高压的机制研究提供更多线索,也为肺动脉高压的治疗提供潜在的靶点。实验目的野百合碱(Monocrotaline,MCT)现在被广泛用来建立肺动脉高压的动物模型,然而其引起肺动脉高压的分子机制一直不清楚。本课题研究旨在揭示野百合碱是否通过作用于细胞外钙敏感受体(Extracellular calcium-sensing receptor,CaSR)引起肺动脉内皮损伤,进而导致肺动脉高压。实验方法1.表达并纯化重组CaSR胞外段蛋白;利用WaterLOGSY(Water-ligandobserved via gradient spectroscopy)技术与 STD-NMR(Saturation transfer difference-nuclear magnetic resonance)技术检测CaSR胞外段蛋白与MCT的相互作用情况。2.用FITC标记MCT,利用激光共聚焦显微镜观察肺动脉内皮细胞上MCT的分布情况和CaSR蛋白的分布情况。3.用Fura-2/AM探针检测肺动脉内皮细胞中钙离子变化,观察MCT对PAEC中CaSR活性的影响。4.用CCK-8试剂盒检测PAEC的存活率,Western Blot检测PAEC中cleaved caspase 3的表达水平。5.构建CFP-CaSR质粒和YFP-CaSR质粒,用FRET技术检测蛋白间的相互作用。6.皮下注射MCT建立肺动脉高压模型,检测模型动物的肺动脉压力值、体循环压力值及心输出量,将模型动物肺组织石蜡包埋、切片、HE染色后,统计其血管壁厚。实验结果1.WaterLOGSY技术与STD-NMR技术检测到CaSR胞外段蛋白与MCT有结合。2.FITC-MCT孵育PAEC后在激光共聚焦显微镜下观察,细胞膜上的荧光强度明显高于胞浆中荧光强度,且与CaSR存在共定位。3.MCT引起PAEC细胞内钙离子浓度显著升高。而加入CaSR特异性抑制剂Calhex231或将CaSR下调后,MCT引起的细胞内钙离子浓度升高明显被抑制。4.MCT导致PAEC存活率显著降低。而加入CaSR特异性抑制剂Calhex231或将CaSR下调后,MCT引起的PAEC存活率降低被逆转。MCT导致PAEC中cleaved caspase 3表达显著升高。而加入CaSR特异性抑制剂Calhex231或将CaSR下调后,MCT引起的PAEC cleaved caspase 3表达升高被抑制。5.构建CFP-CaSR和YFP-CaSR质粒,共转染至PAEC中,再加MCT刺激,从CFP-CaSR转移至YFP-CaSR的能量显著增强。6.单次皮下注射MCT两周后,大鼠肺动脉压力、肺血管阻力、右心肥厚指数及血管壁厚这四个指标均明显升高;而在下调CaSR或敲除CaSR后,与MCT组相比,以上四个指标均显著下降。实验结论MCT能够与CaSR结合,并引起CaSR聚合,从而激活CaSR。CaSR激活引起肺动脉内皮细胞胞浆钙离子浓度升高,导致肺动脉内皮细胞发生凋亡,进而引起肺动脉内皮损伤,最终导致肺动脉高压。