结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis, M. tuberculosis)是引起结核病的病原体。目前由于该病原体和HIV的协同作用以及多重耐药菌株的出现,使曾被有效控制的结核病的发病率在全球范围内呈上升趋势,因此,目前寻找新一代的、能有效对抗这种病原体的药物已成为试图控制这种疾病蔓延研究的中心。细胞壁是分枝杆菌赖以生存的结构基础,其核心结构mAGP (mycolic acid, arabinogalactan, peptidoglycan)由分枝菌酸、聚阿拉伯糖半乳糖及肽聚糖三种成分组成,其中分枝菌酸和聚阿拉伯糖半乳糖(arabinogalactan, AG)通过二糖连接分子(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡萄糖胺)共价连接到肽聚糖大分子上。在肽聚糖和二糖连接分子中共有的组成成分是N-乙酰葡萄糖胺,影响它合成的因素都是寻找药物理想的靶向分子。N-乙酰葡萄糖胺合成过程是一系列的酶促反应过程,其中glmU (Rv1018)是一种双功能酶,在其中催化了两步连续的反应,其一为催化1-磷酸-葡萄糖胺生成1-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺;其二为催化1-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺生成终产物UDP-N-乙酰葡萄糖胺。本课题利用与结核分枝杆菌有相同细胞壁结构,但生长快速且无致病性的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Sm) mc~2155菌株作为实验模型,以glmU基因作为研究对象,并采用基于同源重组的插入突变方法使glmU基因发生突变。目的是用基因敲除的方法证明结核分枝杆菌中glmU基因是分枝杆菌生长过程中所必需的基因,并对glmU基因敲除菌株进行了一系列的表型变化观察及细胞壁结构的聚糖组成成分分析,从而证明glmU基因在分枝杆菌生长过程中具有重要作用,这将为其作为研发抗结核新药的靶标提供有力的证据。本论文获得以下结果:1. Sm glmU基因的扩增和克隆从TIGR基因数据库(http://www.tigr.org/tdb/)获得M. smegmatis mc~2155菌株的glmU基因的核苷酸序列。根据Sm glmU基因的核苷酸序列设计引物,用高保真LA Taq DNA聚合酶从mc~2155基因组中扩增Sm glmU基因及其上游约500 bp的DNA序列,并将其克隆到pMD18-T的克隆质粒上,用BcaBEST测序引物和M13引物对Sm glmU基因的两端进行DNA序列测定,将测序结果与已知的Sm glmU基因进行相似性比较,得到与mc~2155基因组上Sm glmU基因序列完全一致的克隆质粒。2.条件性复制质粒pPR27-xylE-Sm glmU::KanR的构建将来自于质粒pUC4K的KanR克隆到Sm glmU基因内部,产生Sm glmU::KanR突变基因。将Sm glmU::KanR突变基因克隆到pPR27-xylE质粒,构建出条件性复制质粒pPR27-xylE-Sm glmU::KanR。pPR27携带温度敏感型复制子,该质粒在30°C条件下可以复制,在42°C条件下不能复制。pPR27携带的sacB基因为负选择标记,该基因表达产物蔗糖6-果糖基转移酶(Levansucrase)能够分解蔗糖,产生对细菌生长有害的聚果糖,使细菌死亡。xylE基因产物是儿茶酚2, 3-氧化还原酶,它能氧化儿茶酚成黄色的化合物,使菌落呈现金黄色。3.营救质粒的构建营救质粒携带正常的M. tuberculosis glmU基因,其作用是在mc~2155 glmU基因敲除菌株中补偿突变的glmU基因的功能。本实验用高保真LA Taq DNA聚合酶分别从M. tuberculosis H37Rv菌株基因组中扩增Tb glmU基因,构建营救质粒pCG76-Phsp60-Tb glmU。pCG76为分枝杆菌表达质粒,pCG76携带温度敏感型复制子,即该质粒在30°C条件下可以复制,在42°C条件下不能复制。Tb glmU基因的表达受来源于分枝杆菌BCG热休克蛋白60的启动子Phsp60控制。pCG76-Phsp60-Tb glmU营救质粒用于证明Tb glmU是否为分枝杆菌生长相关基因。4.第一次同源重组突变菌株mc~2155 glmU SCO-1的筛选将条件复制性质粒pPR27-xylE-Sm glmU::KanR电转化到mc~2155感受态细胞中。依据pPR27-xylE-Sm glmU::KanR质粒在30°C时能复制,在42°C时不能复制,在42°C条件下培养携带pPR27-xylE-Sm glmU::KanR质粒的mc~2155,迫使pPR27-xylE-Sm glmU::KanR质粒的Sm glmU::KanR与mc~2155基因组中的Sm glmU发生同源重组,使Sm glmU::KanR以及sacB基因、xylE基因整合到mc~2155基因组中。用地高辛标记的Sm glmU探针(DIG-Sm glmU)对经过SmaI酶切的第一次重组菌落的基因组DNA进行Southern杂交分析,当结果中出现预期的杂交条带为发生第一次同源重组的突变菌株mc~2155 glmU SCO-1 (the first single crossover)。5.第二次同源重组突变菌株mc~2155 glmU SCO-2 (glmU基因敲除)的筛选将携带Tb glmU基因的营救质粒转化到mc~2155 glmU SCO-1感受态细胞中,在30°C条件下,在含10 %蔗糖的选择性LB琼脂培养基培养转化的mc~2155 glmU SCO-1,由于pPR27-xylE-Sm glmU::KanR的sacB基因和xylE基因也被整合到mc~2155 glmU SCO-1基因组中,sacB基因的表达产物蔗糖6-果糖基转移酶能水解蔗糖,产生引起mc~2155 glmU SCO-1致死的聚果糖,在这种选择压力下,mc~2155 glmU SCO-1基因组中的Sm glmU::KanR与Sm glmU发生第二次同源重组,将Sm glmU基因、scaB基因以及xylE基因从mc~2155 glmU SCO-1基因组中删除并被核酸酶水解,基因组中只存在Sm glmU::KanR。营救质粒可以在mc~2155 glmU KOT突变菌株中表达出Tb GlmU蛋白质,从而补偿基因组上失活的Sm GlmU的生物学作用。同样地,应用Southern印迹方法筛选出mc~2155 glmU SCO-2 (the second single crossover),即Sm glmU基因敲除菌株mc~2155 glmU KOT (glmU knock out,基因敲除)。6.生长曲线的测定在30°C及42°C条件下,每间隔24小时测定mc~2155 glmU KOT突变菌株在600 nm处的光吸收值,并绘制生长曲线。生长曲线的结果表明,对照的野生型菌株即能在30°C条件下又能在42°C条件下生长;而突变菌株在30°C条件下能够生长,而在42°C条件下却失去生长能力。因而说明了结核分枝杆菌的glmU基因为分枝杆菌生长相关基因。7.温度转换后生长曲线和菌落形成单位(CFU)曲线的绘制mc~2155 glmU KOT菌株和野生型的mc~2155菌株在30°C条件下生长至OD600为0.09,然后转变温度为42°C后继续生长,每隔24小时测定其在600 nm的吸光度值,并绘制生长曲线。温度转换后的生长曲线结果显示,野生型的mc~2155菌株,温度的转换对其生长没有明显的影响;而mc~2155 glmU KOT菌株,在转变温度后的24小时之内,细菌会继续生长,并达到吸光度值的最高值;然而继续延长时间,细菌不再生长,其吸光度值持续下降。对mc~2155 glmU KOT菌株同时进行对可活菌落进行计数的菌落形成单位(colony forming unit, CFU)测定,结果表明mc~2155 glmU KOT菌株的吸光度值与CFU具有相同的趋势,即都在转变温度后的24小时左右达到最高值,接下来持续下降。此结果进一步证实glmU基因为分枝菌酸生长所必需的基因,且mc~2155 glmU KOT菌株在温度转变后光吸收值的降低是由于细菌的死亡。8.应用显微镜技术对细胞形态的观察mc~2155 glmU KOT菌株的生长条件与CFU测定实验中细菌的生长条件相同,收获细菌后,应用光学显微镜和扫描电子显微镜观察其形态。光镜的结果显示,当细胞生长在30°C时细胞呈野生型细菌般的长棒状;但当细胞的生长温度转变为42°C后,虽然初始时细胞依然能维持棒状,但细胞长度却变的比野生型的细胞短很多;随着在42°C生长时间的增加,细胞逐渐开始变为球形,并且时间越长球形细胞所占的比例越大。扫描电子显微镜的结果则更清晰地显示细胞形态的变化,当mc~2155 glmU KOT菌株生长在30°C时,细胞呈典型的棒状;当在42°C生长一定时期后,细胞变短,并有球形趋势产生;随着在42°C生长时间的延长,细胞由短棒状逐渐变为球形,并且细菌细胞壁局部出现缺损,在胞外低渗透压的影响下,细胞肿胀、裂解甚至死亡。因此活性GlmU缺陷导致细菌细胞壁合成障碍,从而对细胞的形态产生影响,并最终导致细胞裂解、死亡。9.应用气相色谱对细胞壁糖组分的分析及应用高效液相Dionex阴离子交换层析对阿拉伯糖组分分析mc~2155 glmU KOT菌株生长在30°C至其吸光度值为0.09后,转移到42°C生长3天,提取细菌细胞壁的核心组分-分枝菌酸-聚阿拉伯半乳糖-肽聚糖(mycolic acid, arabinogalactan, peptidoglycan, mAGP),然后应用气相色谱(Gas Chromatography, GC)分析mAGP中糖的组成成分。本实验中以mc~2155 glmU KOT菌株生长在30°C的细菌作为对照。GC结果表明,在活性GlmU缺失的mc~2155 glmU KOT菌株的mAGP中,阿拉伯糖含量明显增加,半乳糖含量略有增加但不明显;对照菌株与mc~2155野生型菌株相比没有显著不同。用碱裂解法移除mAGP中的分枝菌酸和肽聚糖,使之成为可溶性的聚阿拉伯半乳糖(arabinogalactan, AG)。采用来自纤维单胞菌(Cellumonas gelida)的阿拉伯糖内切酶消化可溶性AG,并应用Dionex阴离子交换层析柱分析被内切酶消化的样品,结果表明,mc~2155 glmU KOT菌株主要产生峰Ara2和Ara6;但也有明显的Ara4峰产生。Ara4峰的存在,说明有结构缺陷的AG,既LAM (lipoarabinomannan)样AG生成。此外,在mc~2155 glmU KOT菌株内,当活性GlmU缺失时,Ara2/Ara6与Ara2/Ara4的峰面积比值减小,由此可说明反映了聚阿拉伯糖末端分支的Ara4和Ara6峰面积相对增大,表明了聚阿拉伯糖末端的分支有增多。结论:本研究以耻垢分枝杆菌mc~2155菌株作为实验模型证明结核分枝杆菌Tb glmU基因的生长相关性。构建了携带Sm glmU::KanR突变基因的条件性复制质粒pPR27-xylE-Sm glmU::KanR,并将其转化入mc~2155,用Southern印记方法筛选出发生第一次同源重组的mc~2155 glmU SCO-1菌株。构建了携带Tb glmU基因的营救质粒,并用营救质粒转化mc~2155 SCO-1,当Tb glmU基因表达时,mc~2155 glmU SCO-1基因组中的Sm glmU::KanR突变基因与Sm glmU基因发生第二次同源重组,用Southern印记方法筛选出发生第二次同源重组的mc~2155 glmU KOT突变菌株,即Sm glmU基因敲除菌株。mc~2155 glmU KOT在30°C和42°C条件下的生长曲线,证实了结核分枝杆菌glmU为分枝杆菌生长所必需的基因;同时温度转换后生长曲线和CFU曲线的结果也进一步印证了glmU基因在分枝杆菌内的生长必要性。通过显微镜技术对细胞形态的观察表明,当活性GlmU不足时可导致细胞形态发生改变,由典型的长棒状变短、变圆;当活性GlmU缺失时,能导致细胞壁局部缺损,由于渗透压的影响而导致细胞肿胀变圆,并裂解死亡。GC与Dionex的结果共同说明了在mc~2155 glmU KOT菌株的细胞壁内,当缺失活性GlmU时,半乳糖含量没有明显变化;而阿拉伯糖含量明显增加,且其增加是来自于具有分支的阿拉伯糖末端的增多。由此推断在活性GlmU缺失的mc~2155 glmU KOT菌株中,负责合成聚阿拉伯糖末端分支的阿拉伯糖基转移酶EmbA和EmbB的表达量降低或功能异常,因而造成mAGP中聚阿拉伯糖末端的改变。本研究为N-乙酰葡萄糖胺作为研发抗结核新药的理想靶标提供了有力的证据;证实活性GlmU的缺失能抑制细菌的扩增,并且会导致细菌因缺乏活性GlmU而裂解、死亡。所获得的Sm glmU基因敲除菌株可作为筛选GlmU抑制剂的细胞模型来筛选先导化合物,以便发现新一代的抗结核药物。