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目的:本研究旨在体外验证过表达和沉默表达Caveolin-1对2型糖尿病小鼠内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)功能、PI3K和AKT表达水平的影响。阐明Caveolin-1是否参与EPCs功能的调节,PI3K/AKT信号通路是否与Caveolin-1对EPCs功能的调节有关。方法:(1)EPCs原代培养及鉴定:体外分离培养8周龄雄性2型糖尿病db/db小鼠骨髓EPCs,采用密度梯度离心法获取单核细胞,再将单核细胞接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中进行培养传代;通过免疫荧光鉴定EPCs。(2)转染EPCs及检测转染效果:分别采用过表达慢病毒空白载体、过表达慢病毒载体、沉默表达慢病毒空白载体和沉默表达慢病毒载体转染EPCs。故本研究分为过表达空白载体组、过表达组、沉默表达空白载体组、沉默表达组和未转染的对照组。通过慢病毒感染效率探索各组慢病毒转染的最佳MOI值,确定转染时加入EPCs的病毒量。通过实时荧光定量PCR法(qPCR)分别检测各组慢病毒载体(包含3个沉默表达慢病毒载体和一个过表达慢病毒载体)转染EPCs后Caveolin-1的mRNA表达水平,评估转染效果,筛选沉默效率最高的沉默慢病毒载体进行后续实验。(3)检测转染后EPCs功能:分别检测各组2型糖尿病小鼠EPCs转染慢病毒成功后,细胞增殖、迁移、粘附和血管生成功能。(4)检测转染后EPCs的PI3K和AKT表达水平:通过qPCR和Western blot分别检测各组2型糖尿病小鼠EPCs转染慢病毒成功后,PI3K和AKT的mRNA及蛋白表达水平。结果:(1)检测培养细胞的DiI-ac-LDL及FITC-UEA-I双染阳性率为73.50±7.47%;免疫荧光鉴定显示培养细胞的表面抗原CD31、CD34、CD133、CD144、VEGFR2表达均为阳性,培养的细胞为EPCs。(2)筛选出最高沉默效率的慢病毒载体为LV-Cav1-RNAi(37949-1)。明确过表达空白载体组、过表达组和沉默表达组最佳MOI均为50,沉默表达空白载体组最佳MOI为10。(3)过表达空白载体组和沉默表达空白载体组分别与对照组相比,Caveolin-1的mRNA表达水平差异无统计学意义。过表达组EPCs的Caveolin-1 mRNA表达水平较过表达空白载体组升高4.13倍(P<0.05),沉默表达组EPCs的Caveolin-1 mRNA表达水平降至沉默表达空白载体组的5.6%(P<0.05)。Caveolin-1过表达和沉默表达慢病毒载体转染EPCs成功。(4)2型糖尿病小鼠EPCs的Caveolin-1过表达后,其增殖能力降至过表达空白载体组EPCs的61.9%;迁移能力降至过表达空白载体组EPCs的28.5%;粘附能力降至过表达空白载体组EPCs的92.7%;血管生成中形成管状结构数和主干长度分别降至过表达空白载体组EPCs的49.9%和54.5%。(5)2型糖尿病小鼠EPCs的Caveolin-1沉默表达后,其增殖能力降至沉默表达空白载体组EPCs的70.4%;迁移能力降至沉默表达空白载体组EPCs的34.4%;粘附能力降至沉默表达空白载体组EPCs的80.6%;血管生成中形成管状结构数和主干长度分别降至沉默表达空白载体组EPCs的64.4%和54.8%。(6)过表达空白载体组和沉默表达空白载体组分别与对照组相比,PI3K和AKT表达水平差异无统计学意义。过表达组PI3K和AKT的mRNA及蛋白表达水平明显低于过表达空白载体组(P<0.05)。沉默表达组PI3K和AKT的mRNA及蛋白表达水平明显低于沉默表达空白载体组(P<0.05)。EPCs的Caveolin-1过表达和沉默表达均降低其PI3K和AKT表达水平。结论(1)2型糖尿病小鼠EPCs的Caveolin-1沉默表达不同程度地抑制其增殖、迁移、粘附和血管生成功能。(2)2型糖尿病小鼠EPCs的Caveolin-1过表达不同程度地抑制其增殖、迁移、粘附和血管生成功能。(3)PI3K/AKT信号通路的激活与2型糖尿病小鼠EPCs增殖、迁移、粘附和血管生成功能成正相关,Caveolin-1通过PI3K/AKT信号通路调节EPCs功能。(4)Caveolin-1是调节EPCs增殖、迁移、粘附和血管生成功能的关键蛋白,这为促进EPCs功能,防治2型糖尿病患者心血管并发症提供理论依据。