研究背景:目前,肺癌是全球发病率和致死率最高的恶性肿瘤。临床上,肺癌的组织类型主要包括非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC)和小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer,SCLC)。在临床肺癌病例中,NSCLC类型最常见,所占比例高达80%左右。传统治疗肺癌患者的方法主要包括放疗、化疗及手术切除。由于肺癌细胞具有恶性增殖能力强,易侵袭和转移、放化疗不敏感等特点,导致肺癌晚期患者生存预后不佳,总体5年生存率仅有10%左右。为了提高肺癌治愈率、改善治疗预后,寻找和鉴别早期诊断和预后的肿瘤标记物,并深入探讨其在癌症发生发展过程中的分子机制是非常重要的。肿瘤干细胞和干细胞功能基本一样,都具有自我更新和无限增殖的能力,具有高迁移侵袭能力,和排出有毒化学因子的能力。因此,肿瘤干细胞也被认为在药物耐药性及肿瘤转移中起着重要的作用。已有文章明确表明肿瘤干细胞乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌等密切相关。由人类5pl3染色体上基因编码的高尔基磷酸蛋白3(Golgi phosphorprotein3,GOLPH3),是一类与高尔基体囊泡转运、蛋白糖基化及蛋白分选相关的磷蛋白。GOLPH3是首个定位于反面高尔基网(Trans-Golgi Network,TGN)的癌基因,已证实了GOLPH3与包括NSCLC在内的多种癌症的发生发展密切相关,但GOLPH3在NSCLC干细胞样表型中的临床意义和生物学功能还知之甚少。Wnt/β-catenin信号通路是调节干细胞分化的主要信号通路,已经发现Wnt/β-catenin信号通路与肺癌、结肠癌、肝癌的发生发展密切相关。因此,进行GOLPH3在NSCLC干细胞样表型中的研究具有非常重要的临床意义。目的:本课题拟在体内、体外实验的基础上,辅以生物信息学分析技术,研究GOLPH3在促进NSCLC干细胞样表型增强中的生物学功能,并初步探究GOLPH3通过Wnt-β-catenin-LEF1/TCF4通路调控NSCLC干细胞样表型增强的可能机制。方法:Western Blot检测已构建的A549、NCI-H460细胞系中GOLPH3的表达稳定性;在NCBI-NSCLC公用数据库中,用SPSS分析软件分析GOLPH3的表达与肿瘤干细胞markers之间的关系;在构建好的稳定细胞系中,用实时荧光定量PCR技术、侧群细胞检测实验及细胞成球实验,分别检测GOLPH3的表达对肿瘤干细胞markers转录情况的影响、对侧群细胞所占比例的影响、对NSCLC细胞成球能力的影响。购买SPF级的4-5周龄Balb/c裸鼠,随机分组,收集构建好的稳定A549细胞系细胞,分成不同的浓度,皮下注射到裸鼠腹股沟处,观察裸鼠的成瘤情况,每隔3天测量一次瘤块大小;30天后猝死裸鼠,剥离出肿瘤块,称重并计算体积。用免疫组织化学法检测肿瘤组织块中GOLPH3及肿瘤干细胞markers(CD133、ALDH1A1)的蛋白表达水平。通过基因富集分析软件(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)预测GOLPH3促进NSCLC干细胞样表型增强的潜在分子机制,并采用双荧光素酶报告基因检测GOLPH3是否通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进NSCLC干性增强;采用免疫荧光实验、核质分离实验检测构建的稳定细胞系中GOLPH3的表达对β-catenin分布情况的影响。并用实时荧光定量PCR检测GOLPH3对下游干细胞样表型相关靶基因转录水平的影响。用Lipo3000将si RNA(si TCF4/si LEF1)瞬时转染到GOLPH3稳定高表达的A549、NCI-H460细胞系中构建TCF4/LEF1沉默表达的NSCLC细胞系;在构建的瞬时细胞系中,用双荧光素酶报告基因检测Wnt/β-catenin信号通路的活性;侧群细胞检测实验检测侧群细胞所占比例的变化;实时荧光定量PCR检测下游干细胞样表型相关靶基因的转录水平。结果:Western Blot检测已构建的A549、NCI-H460细胞系中GOLPH3的表达情况时,发现GOLPH3的高、低表达趋势都很明显,说明构建的NSCLC细胞系稳定性较好,可以继续进行下一步实验。SPSS软件分析发现:公用数据库中GOLPH3的表达与肿瘤干细胞makers(ABCG2、ALDH1A1、CD133、c-Myc、Sox2)的表达呈现正相关性,且p<0.01。初步说明NSCLC中,GOLPH3的表达可能与肿瘤干细胞样表型相关。实时荧光定量PCR的结果也表明,GOLPH3高表达时,肿瘤干细胞markers的转录水平升高;GOLPH3低表达时,肿瘤干细胞markers的转录水平降低。侧群细胞检测实验表明:GOLPH3高表达时,侧群细胞占总细胞比例较大;GOLPH3低表达时,侧群细胞占总细胞比例较小。干细胞成球实验结果显示:相比于对照组,当GOLPH3高表达时,细胞形成干细胞球的能力较强,小球形成的体积更大,数量更多,且速度更快;GOLPH3低表达时,细胞形成干细胞的能力则较弱,小球形成体积较小,数量较少,速度缓慢。这些体外实验充分说明:NSCLC中,GOLPH3高表达可以促进肿瘤干细胞样表型增强,GOLPH3低表达则抑制肿瘤的干细胞样表型。裸鼠成瘤实验结果发现:GOLPH3高表达可以使裸鼠体内种植的肿瘤细胞具有更强的致瘤能力,肿瘤块形成的体积更大,速度更快;GOLPH3沉默表达时,裸鼠体内种植的肿瘤细胞的致瘤能力明显低于对照组,无论是肿瘤块形成的体积还是速度,都明显小于对照组。体内实验也说明了:NSCLC中,GOLPH3高表达可以促进肿瘤干细胞样表型增强,GOLPH3低表达则抑制肿瘤的干细胞样表型。通过GSEA分析发现GOLPH3与Wnt/β-catenin信号通路呈现正相关,且具有统计学意义。双荧光素酶报告基因检测实验也发现:GOLPH3高表达可以激活Wnt/β-catenin信号通路,下调GOLPH3的表达则抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性。免疫荧光实验、核质分离实验发现:GOLPH3高表达可以促进β-catenin由细胞质进入细胞核并累积,在核蛋白中呈现高表达;GOLPH3低表达时,β-catenin主要分布于细胞质中,在核蛋白中表达水平很低。实时荧光定量PCR结果也发现:GOLPH3高表达时,Wnt/β-catenin信号通路下游的干细胞样表型相关靶基因转录水平较高;GOLPH3低表达时,Wnt/β-catenin信号通路下游的干细胞样表型相关靶基因转录水平则较低。沉默掉TCF4/LEF1后,侧群细胞实验显示:相比于对照组,实验组总细胞中侧群细胞所占比例明显降低。实时荧光定量PCR结果也显示:相比于对照组,实验组细胞中Wnt/β-catenin信号通路下游的干细胞样表型相关靶基因转录水平明显降低。这些结果有力说明了:GOLPH3促进NSCLC干细胞样表型增强的过程受Wnt/β-catenin信号通路的调控。结论:实验结果表明,癌基因GOLPH3的表达可以调控NSCLC干细胞样表型的强弱,GOLPH3高表达可促进NSCLC干细胞样表型增强,GOLPH3低表达则抑制NSCLC的干细胞样表型。上调GOLPH3的表达可以激活Wnt/β-catenin信号通路,在信号因子的刺激下,β-catenin进入细胞核与转录调节因子TCF4/LEF1结合,启动下游靶基因的表达,增强NSCLC肿瘤干细胞样表型。沉默TCF4/LEF1可以阻断Wnt/β-catenin信号通路,GOLPH3高表达增强NSCLC干细胞样表型增强的能力下降。