牛舌草（Anchusa azurea Mill.）是紫草科牛舌草属植物。牛舌草属,包括35种植物,是紫草科的一个属,一般生长于开阔的田地和废弃的土地。牛舌草属植物多分布于欧洲和亚洲,其中地中海地区和中东地区是牛舌草属的主要生长地,只有三种不分布在此地区,分别是A.affinis R.（生长于埃塞尔比亚和阿拉伯以西的高地）,A.capenis Thunb.和A.riparia DC.（发现于南非）。牛舌草属多为一年生、二年生或多年生草本植物,有硬毛花冠漏斗状,小坚果斜卵形,直立,有褶皱,腹面龙骨状,着生面在果的底部,有环状边缘和脐状突起。种子直立,子叶卵形,扁平。根据基因ITS1和trn L的序列,牛舌草属可分为4个亚属（Buglossum,Buglossoides,Buglossellum,Anchusa）。牛舌草是牛舌草属中的一种,为多年生植物,有刚毛,50～100厘米高,有细长且窄的叶子和小的管状的蓝紫色花朵。牛舌草通常生长在温带地区,尤其是地中海地区,从靠近海平线到低海拔的山区都有分布。花期根据环境不同一般为五月到六月。在地中海地区的国家如土耳其和希腊,牛舌草经常被当作传统药物用来治疗外伤。在托罗斯山脉中部,干燥的牛舌草叶子研成粉末用作伤口的干燥剂,根部煎煮后与蛋黄、蜂蜡混合制成膏剂治疗外伤。在之前的报道中,已有多种化合物（三萜类和三萜皂苷,黄酮类,吡咯里西啶生物碱,酚酸类等）从牛舌草属植物中分离并鉴定。牛舌草属植物的种子同时还是脂肪酸和挥发油的丰富来源。对于牛舌草属植物化学成分的研究已经延续多年。最早从此属中分离并鉴定的结构是三萜类化合物,于上世纪80年代发现。三萜类化合物及其糖苷类化合物是牛舌草属非常重要的成分,广泛分布于多种植物中。从2010年开始,更多的学者开始关注对牛舌草（Anchusa azurea）的研究,并从中分离出多个新的萜类化合物。酚类化合物是除三萜类化合物以外广泛存在于牛舌草属植物中的化学成分,近年来越来越因其多种多样的生物活性而受到广泛关注。根据已发表的文献,13种酚类化合物包括迷迭香酸,安息香酸,芦丁等从A.undulata subsp.hybrida的甲醇提取物中分离并鉴定,其中迷迭香酸被证实是牛舌草属植物含量最多的成分。部分黄酮类化合物也被认为是酚类化合物,同样从牛舌草中分离得到。根据文献报道,紫云英苷、异槲皮苷、芦丁和山柰酚-3-O-α-鼠李糖-（1’’’-6’’’）-β-葡萄糖苷、迷迭香酸等从牛舌草中分离得到。吡咯里西啶类生物碱因其广泛存在于植物并具有一定毒性而被研究。在土耳其和埃及,骆驼、山羊、蝗虫等动物都不会食用紫草科植物,这表明紫草科植物有一定的防御机制。后续的研究也表明牛舌草属的植物是吡咯里西啶类生物碱的丰富来源,但是未在牛舌草中发现此类生物碱。牛舌草属植物的生物活性也被许多学者广泛研究。在地中海地区,牛舌草植物常被用作治疗外伤的传统药物,并因此受到了学者们的关注。酚酸类和黄酮类化合物是牛舌草植物中的主要成分。在从前的研究中发现,高含量的酚酸类和黄酮类化合物使牛舌草的甲醇提取物有显著的抗氧化性。炎症是广泛存在的疾病,通常选择非甾体类抗炎药物治疗,但这一类药物会导致严重的溃疡副作用。研究表明,牛舌草的甲醇提取物及正丁醇相有显著的随浓度变化而变化的抗炎作用。其中,牛舌草的主要成分迷迭香酸同样显现出高效的抗炎作用。牛舌草的抗癌作用也被研究。牛舌草的甲醇提取物曾被用来研究对乳腺癌细胞（MCF-7）、肝癌细胞（Hep G2）和结肠癌细胞（Lo Vo）增殖的影响。结果表明,其甲醇提取物对肝癌细胞和结肠癌细胞具有抗增殖效果,分别可抑制到20%和30%,但对乳腺癌细胞没有抑制作用。糖尿病也是世界范围内非常常见的内分泌疾病,特点是高血糖浓度,并容易引起眼部的、中枢神经系统的和肾脏的并发症。2型糖尿病最初的症状是胰岛素抵抗,血清中自由脂肪酸的含量是导致胰岛素抵抗的重要因素之一,因其可降低葡萄糖摄取并抑制肌肉对葡萄糖的利用率。激素敏感性脂解酶（hormone-sensitive lipase,HSL）是自由脂肪酸降解的重要限速酶,可以作为治疗2型糖尿病的潜在靶点。牛舌草的甲醇提取物对激素敏感性脂解酶有显著的抑制作用,IC₅₀值为132.8μg/m L,为治疗2型糖尿病提供了新的治疗途径。除了以上生物活性之外,牛舌草的提取物还具有治疗痛风、抗菌、抗溃疡、抗病毒等作用。这些生物活性大大地扩大了牛舌草的临床应用,使其应用不仅局限于传统医药。作为传统药物,牛舌草常被用在各个方面,最常见的有外伤的治疗和利尿剂。同样地,牛舌草属中的其他植物也经常有医药应用,这使得对牛舌草属植物的研究越来越多。到目前为止,对牛舌草的化学成分的研究已有报道,主要集中在分离和鉴定纯化合物,特别是三萜类、黄酮类和脂质类化合物。本研究一个目的则是发现并鉴定更多未报道过的化学成分。化学分类的意义也将在此讨论。生物活性研究也是本课题的重要部分。根据以往的报道,许多如抗癌、抗菌、抗炎等生物活性已被研究,但大多研究都集中在醇提取物或经初步处理后的馏分。虽然这些报道为牛舌草生物活性的研究提供了方向,但单一化学成分的活性还需要更深入地研究。在本课题中,经液液萃取处理后的四个馏分（正己烷相,二氯甲烷相,正丁醇相,水相）和纯化合物的抗菌活性将被检测以期可以发现具有活性的单一成分,至少缩小研究范围,为后续的研究打下基础。本课题所用的植物为整株植物,于2006年五月在亚美尼亚采集。牛舌草样品采集后去除沙土,在阴凉处自然风干。风干的植物磨成粉末,总重约为1 kg。样品粉末于室温下在甲醇中浸泡提取3次,提取后的甲醇溶液于真空中挥发多余溶剂,使提取物浓缩成膏状。浓缩后的甲醇提取物重新溶90%甲醇水溶液中,然后进行液液萃取。根据所含化学成分和萃取所用溶剂的极性,甲醇提取物被分为四个馏分,分别是正己烷相、二氯甲烷相、正丁醇相和水相。本课题的分离纯化工作集中于二氯甲烷相和正丁醇相。二氯甲烷相通过硅胶柱色谱分离,采用二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶剂洗脱,得到19个馏分。后经反相高效液相色谱分析,制备色谱分离并纯化得到单一成分。正丁醇相通过大孔树脂柱色谱分离,采用不同比例的甲醇和水的混合溶剂进行洗脱,得到极性从大到小的5个馏分。后经反相高效液相色谱分析,制备色谱分离并纯化得到纯化合物。单一成分的结构鉴定以核磁谱图为主,氢谱、碳谱和其他2D谱图在结构鉴定中均起到重要的作用。氢谱可提供与质子相关的信息,如不同化学环境下各种质子的个数比,每种质子的化学位移,当使用的氘代试剂为DMSO时,也可观察到部分活泼氢的质子信号。碳谱则可以提供碳原子的化学位移和个数,以及碳骨架的相关信息。2D核磁谱图有多种,COSY谱是同一个偶合体系中质子之间的偶合相关谱,可以确定质子化学位移以及质子之间的偶合关系和连接顺序;HSQC谱是¹H和¹³C的一键相关谱;HMBC谱为¹H的异核多键相关谱,将¹H核和远程偶合的¹³C核关联起来,可以提供2～3键的质子与碳的偶合信息。通过整合一维和二维核磁谱的信息可以推测出化合物的平面结构。但从天然产物中分离的化合物多具有手性中心,为确定其立体结构,NOESY谱可以用来确定化合物的相对立体构型。除核磁外,为确定绝对构型,CD谱也用来帮助确定化合物的绝对构型。通过观察CD谱图中曲线的Cotton效应,来确定化合物左旋或右旋,得到的数据和文献比较后可确定化合物的绝对结构。除核磁和圆二色谱外,其他分析方法也可用于结构鉴定的辅助,紫外可见吸收光谱中的吸收波长可帮助确定官能团的存在和化合物的类型,高分辨质谱则可提供化合物的分子量等信息,根据其所提供的分子量可计算出有可能的分子式。在本课题中,对牛舌草的抗菌活性也做了一定的探究。8种致病细菌和8种致病真菌在此实验中做了检测,检测样品包括经液液萃取处理的四个馏分,19个从二氯甲烷相分离的得到的馏分,5个从正丁醇中分离得到的馏分。经过一系列的分离纯化和结构鉴定,共有17个化合物从二氯甲烷相和正丁醇相中分离得到,分别是迷迭香酸（1）、迷迭香酸甲酯（2）、紫云英苷（3）、异槲皮苷（4）、山柰酚-3-O-α-鼠李糖（1’’’-6’’）-β-葡萄糖苷（5）、4-hydroxy-N-（4-（3-（4-hydroxy-phenyl）-E-acryloylamido）-butyl）-benzamide（6）、1-O-β-d-glucopyranosyl-1,4-dihydroxy-2-（3’,3’-dimethylallyl）-benzene（7）、4-羟基苯甲酸（8）、oresbiusin A（9）、benzyl-O-β-d-glucopyranoside（10）、3,4-二羟基肉桂酸甲酯（11）、α-亚麻酸（12）、（-）-黑麦草素（13）、（-）-黑麦草内酯（14）、（-）-丁香酯素（15）、（-）-表丁香酯素（16）、2α,3β,19α-trihydroxyurs-23-aldehyde-12-en-28-oic-acid（17）。17个化合物中包括4个苯丙酸类及其衍生物（1,2,9,11）,3个黄酮苷类（3,4,5）,1个苯丙胺类（6）,1个脂肪酸（12）,2个单萜类（13,14）,2个木脂素类（15,16）,1个三萜类（17）和3个芳香小分子化合物（7,8,10）。化合物1-5,8,12,17为已知结构,曾在从前的文献中报道过。化合物9和化合物11属苯丙素衍生物类,分别是丹参素A和咖啡酸的衍生物,在牛舌草属中第一次发现。化合物9多被发现于唇形科,此次则是化合物9在紫草科植物中第一次发现,而化合物11曾在紫草科破布木属中分离得到。三萜类及其皂苷是牛舌草属的特征性化合物,而单萜类化合物少被报道。（-）-黑麦草素（13）和（-）-黑麦草内酯（14）是一对立体异构体,属单萜类化合物,曾从紫草科天芹菜属中分离得到,但此次属第一次在牛舌草属中发现。化合物6是唯一一个从牛舌草属中发现的苯丙胺类化合物,并从未在文献中报道过,同时根据文献报道,化合物6只在紫草科盾果草属植物中得到过。木脂素,尤其是骈双四氢呋喃类木脂素极少在紫草科植物中报道。化合物15和化合物16为一对立体异构体,在本实验中第一次从紫草科植物中分离得到。本实验中还分离鉴定出3个芳香小分子化合物,分别是化合物7、化合物8和化合物10,化合物8为已知化合物。化合物7和化合物10都是结构简单且广泛存在于天然产物中的成分,化合物7常存在于菊科植物,化合物10则常发现存在于菊科、桑科和紫葳科植物中。在紫草科植物中这是首次分离得到化合物7和化合物10。在生物活性检测中,正己烷相和二氯甲烷相对致病细菌Streotococcus mutans（ATCC 25175）和Enterococcus hirae（ATCC 8043）均有明显的抑制作用。在19个二氯甲烷相经硅胶柱色谱分离得到的馏分中,第8,9,10,11个馏分对Streotococcus mutans（ATCC 25175）有抑制作用。从8,9,10,11馏分中分离得到相同的成分化合物12。经抗菌实验验证,其对致病细菌Streotococcus mutans（ATCC25175）具有明显的抑制作用,化合物DMSO溶液浓度为10 m M时,抑菌圈直径约为6 mm,最小抑菌浓度为62.5～125μM。在第18个馏分中分离得到三萜类化合物17,对其进行活性筛选的结果显示其对致病细菌Enterococcus hirae（ATCC8043）具有较明显的抑制作用,最小抑菌浓度为125～250μM。同时,二氯甲烷相对致病真菌Candida rugosa（ATCC 10571）也具有抑制生长的作用。从二氯甲烷相中分离出的19个馏分中,第8,18,19个馏分显示出对Streotococcus mutans（ATCC 25175）的抑制作用。从中分离得到的化合物17对该真菌有较微弱的抑制作用,未测到其最小抑制浓度。本课题从紫草科牛舌草属植物牛舌草的化学成分和生物活性两个方面做了一定探究。在此植物中,17种单一成分化合物被分离,其中9个化合物为首次在牛舌草属中发现,5种第一次从紫草科中分离。这些新化学成分的发现和鉴定增加了紫草科牛舌草属植物中已知化学成分的种类,深入了本属植物的研究。这些成分的分离与鉴定作为本属植物的特征成分可帮助本属植物的生源鉴定。生物活性检测则显示出其对致病菌的显著抑制作用,为后续的生物活性研究打下基础。