【摘 要】
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棉铃虫(Helicoverpa armigera.Hübner)在取食棉花时产生的分泌物在研究棉花与棉铃虫互作机制中发挥着重要作用,其口腔分泌物中存在许多未知功能的蛋白小分子,如诱导植物防御反应的激活子,抑制植物防御反应的效应子等。通过研究棉铃虫口腔分泌物中效应子在调控棉花中抗虫防御反应的作用以及在棉花中互作靶点蛋白之间的研究,可为创制抗棉铃虫棉花提供靶点,也可为棉花抗虫种质的培育提供理论依据。本
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棉铃虫(Helicoverpa armigera.Hübner)在取食棉花时产生的分泌物在研究棉花与棉铃虫互作机制中发挥着重要作用,其口腔分泌物中存在许多未知功能的蛋白小分子,如诱导植物防御反应的激活子,抑制植物防御反应的效应子等。通过研究棉铃虫口腔分泌物中效应子在调控棉花中抗虫防御反应的作用以及在棉花中互作靶点蛋白之间的研究,可为创制抗棉铃虫棉花提供靶点,也可为棉花抗虫种质的培育提供理论依据。本研究从棉铃虫唾液腺EST(PRJNA388211)数据库中通过生物信息学方法筛选到19个候选效应子,通过烟草瞬时表达和棉花遗传转化实验进一步筛选与验证候选效应子在植物中的影响。结果如下:1.19个候选效应子中有11个已知功能性蛋白,一个脂类相关蛋白MD-2家族5481(XM-021325481)、一个昆虫信息素相关蛋白4835(XM-021334835)、两个类丝氨酸胰蛋白酶0600(XM-021340600)和3673(XM-021343673)、四个类丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白6086(XM-021346086)、2397(XM-021342397)、2398(XM-021342398)和2399(XM-021342399)、一个胰岛素样生长因子6326(XM-021326326)、一个胰岛素样生长因子结合蛋白0252(XM-021340252)。2.在本氏烟草中瞬时表达,进行细胞死亡诱导测定,结果发现7997(XM-021327997)诱导烟草细胞坏死反应,而其余蛋白不会引起烟草细胞坏死。在棉花中的稳定表达这19个候选效应子,成功获得了四种效应子蛋白转基因材料,分别是24株0600、20株2191(XM-021332191)、14株5481、4株4835。对这四种转基因材料进行阳性检测,有12株0600阳性单株、8株5481阳性单株、11株2191阳性单株。进一步对阳性材料进行表达量检测,结果表明0600-1、0600-10、0600-34、0600-54、0600-43、0600-53;2191-2、2191-8、2191-25、2191-35、5481-9、5481-24、5481-31、5481-33、5481-40、5481-46、5481-57植株中目的基因表达量高。这些材料将作为后续研究的重点材料。3.选取表达量高的转基因株系进行棉铃虫抗性实验,发现取食0600-10、0600-34和0600-54效应子转基因材料的棉铃虫在第8天的体重比对照材料组平均体重增加0.06g-0.12g,虫体长度也明显增加2mm左右。取食2191-27、2191-30和2191-25转基因株系棉花的棉铃虫较对照组平均体重增加了0.04g-0.15g,体长比对照组棉铃虫长2mm-3mm。取食5481-9、5481-40和5481-31转基因株系棉花的棉铃虫较对照组平均体重增加了0.02g-0.09g,体长增加2mm-3mm。结果表明棉铃虫效应子的在棉花中表达可能降低了棉花中的防御反应。4.检测转基因材料中JA和SA相关基因的表达水平,发现转基因材料中JA相关基因LOX1、PDF1.2和JAZ10转录水平显著降低,SA合成基因ICS显著升高,SA信号路径上的调控基因NPR1、PR2显著降低,相对于对照材料。数据结果说明在棉花中稳定表达0600、2191、5481触发了激素相关的途径,从而提高了棉铃虫对转基因材料的敏感性,进一步证实了棉铃虫2191、5481、0600在棉花中的表达降低了棉花中的防御。
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